关于猫爪草对耐多药结核分枝杆菌感染小鼠细胞免疫的作用

【摘要】 目的 探讨猫爪草提取物对耐多药结核分枝杆菌（multiple drugs resistant bacillus tuberculosis， MDR-TB）感染小鼠免疫功能的调节作用。方法 采用MDR-TB菌液灌胃制备小鼠MDR-TB感染病理模型，将30只健康小鼠随机分为3组，每组12只，分为正常组、模型组和猫爪草提取物组；采用ELISA法检测小鼠血清中与结核细胞免疫密切相关的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12含量的变化。结果 猫爪草组与模型组比较，IFN-γ、IL-12含量明显升高，IL-4、IL-10含量明显下降（P&<0.05或P&<0.01）。结论 猫爪草提取物可以通过上调细胞因子增强小鼠的细胞免疫功能，为临床应用猫爪草治疗耐多药结核病提供了理论依据。
【关键词】 猫爪草 提取物 MDR-TB 细胞因子 免疫功能
【Abstract】 Objective: To investigate the regulative effect of the extract of Radix Ranunculi Ternati on cellular immunity induced by MDR-TB in rats. Methods: MDR-TB model in rats was induced by MDR-TB. Normal control group， model group and Radix Ranunculi Ternati group were set up. The content of IFN-γ， IL-4， IL-10 and IL-12 were examined by ELISA. Results: Compared to the model group， Radix Ranunculi Ternati group resulted in significant in serum IFN-γ， IL-12， IL-4 and IL-10 (P&<0.05 or P&<0.01). Conclusion: The extract of Radix Ranunculi Ternati can enhance the cellar immunological function in rats， accordingly provide the theory base of healing of tuberculosis with it.
【Key words】 Radix Ranunculi Ternati extract MDR-TB cytokine immunological function
　　结核病严重危害人类健康的传染病之一，自20世纪80年代以来，因为滥用抗结核药物和艾滋病病毒（HIV）等感染而导致全球性结核病疫情回升[1]，耐多药结核分枝杆菌成为临床治疗的难点。近年来，依据猫爪草具有清热解毒之功效，临床上用于医治癌肿等，取得一定疗效，已成为国家重点发展的三类药材之一[2]。本研究从免疫学角度通过猫爪草提取物对小鼠细胞免疫功能的影响，探讨其对MDR-TB治疗效果。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料 IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12 ELISA双抗体夹心试剂盒（深圳晶美公司产品）；；EXL808全自动酶标仪（美国BIO-TEK公司产品）；选用昆明种成年小鼠，体重（20±2）g，雌雄各半，由安徽医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：皖医实动准第01号）。
　　1.2 MDR-TB感染动物模型的建立 将转种纯化后的MDR-TB菌落刮取，加无菌生理盐水磨菌制备成1mg/ml的菌液，经尾静脉注射2 ml菌量感染小鼠[3]。
　　1.3 中药提取物的制备 将猫爪草中药粗粉，以水为溶剂加热回流提取，过滤，20%乙醇沉淀除去杂质，浓缩，冻干得水提取物；将同批次药材粗粉，以75%乙醇加热回流提取，浓缩，冻干得醇提取物[4]。
　　1.4 实验动物分组 将30只小鼠随机分为3组，每组10只， 雌雄各半。正常组每天正常标准饲料喂养，模型组生理盐水5 ml灌胃，猫爪草提取物组灌服猫爪草中药醇提取物，每天按照浓度200 mg/kg 5 ml灌胃，在再加入标准饲料，连续4周，第4周后处死动物，收取血清（将血液3000 rpm×20 min，取上清，灭活，过滤除菌）[5]。
　　1.5 ELISA检测：
　　按照IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的ELISA双抗体夹心试剂盒说明进行操作，将待测样品150 ul分别加入到预先已用各抗小鼠IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12单克隆抗体包被的酶标板上；将反应板充分混匀后置37℃温箱120 min，使标准品、待测样品中的抗原与单抗充分结合；洗板；每孔中加入生物素化的各一抗工作液50 ul，置37℃温箱60 min；洗板；每孔加辣根过氧化物酶标记的Streptavidin抗体工作液100 ul，将反应板置37℃温箱60 min，；洗板；每孔加入OPD（邻苯二胺）底物工作液100 ul，置37℃暗处反应5-10 min；每孔加入1滴终止液（2M h3SO4）混匀；采用酶标仪在492 nm处测各孔吸光度OD值。根据样品OD值在该曲线图上查出每ml组织匀浆中相应炎症因子的含量，再除以蛋白含量即为每mg组织蛋白中各细胞因子的含量。
　　1.6 资料统计分析：
　　采用 SPSS10.0系统进行分析。
　　2 结果
　　2.1 ELISA试验结果：见表1。
　　表1 各实验组小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的ELISA检测结果（x±s）
　　Table 1 Results of IFN-γ， IL-4 ， IL-10和IL-12 in serum in rats in by ELISA
　　
　　注：△P&<0.05，△△P&<0.01 vs 正常组；*P&<0.05，**P&<0.01 vs 模型组 　　3讨论
　　猫爪草2005年已被《中国药典》收载，其名始见于《中药材手册》，原植物为毛茛科毛茛属植物小毛茛，为少用草药，历代本草未见收载。猫爪草是20 世纪50 年代河南信阳地区发现的一种新的验方药材，其性味甘、辛，性平，归肝、肺经。猫爪草以块根供药用，具有消肿、散结的功能 [6]。目前临床上猫爪草提取物用于医治癌肿、淋巴结核等取得一定疗效，但具体的作用机制并不明确[7，8]。
　　结核分枝杆菌是一种细胞内寄生菌，以T细胞为主的细胞免疫为主。结核特异性CD4+ T细胞是辅助T细胞（Th1），能够产生IFN-γ，IFN-γ是激活巨噬细胞抗结核活性的中心活性因子。激活的巨噬细胞增殖、分泌IL-　　12，促进Th0细胞向Th1分化，进一步扩大Th1细胞免疫的应答。Th3 型细胞因子如IL-4、IL-10虽然也有分泌，但由结核分枝杆菌引发的却相当少[9，10]。
　　研究中，我们通过ELISA试验发现，猫爪草提取物对MDR-TB感染小鼠血清中细胞因子含量的影响极大，MDR-TB感染小鼠血清中IFN-γ、IL-12含量明显下降，IL-4、IL-10含量明显升高，和正常组（P&<0.05）及模型组（P&<0.01）相比有显著性差异。结果证明了结核病的发生与人体Th1/Th3 细胞应答平衡有关，猫爪草提取物对Th1/Th3 细胞应答平衡均具有一定的调整作用，明显增强了MDR-TB感染小鼠的细胞免疫应答，对治疗结核病起到关键作用。
　　综上所述，适当浓度的猫爪草提取物可增强MDR-TB感染小鼠的细胞免疫功能， 为临床治疗结核病提供实验依据，对其他细胞因子的作用，还需进一步深入研究。
　　参 考 文 献
　　[1] Telenti A， Lseman M. Drug-resistant tuberculosis [J]. Drug， 2000，59(2):171-179.
　　[2] 张振凌，吴筱菁，王磊，等.中药猫爪草有效部位的免疫活性研究[J].中华中医药杂志， 2007，22(02):120-122.
　　[3] 李建国，高爱社，刘湘花，等.淋巴结核丸对MDR-TB感染小鼠的保护性及内脏病变程度影响的实验研究[J].河南中医学院学报，2008，23(1):134-135.
　　[4] 郭学敏，洪永福，周卓轮.毛茛属植物化学成分研究概况[J]. 中草药，2001，32(8):748-750.
　　[5] 刘明霞，孙付军，王春芳，等.黄连解毒汤70 %醇提物对MDR模型小鼠细胞凋亡及相关因子表达的影响.中药材，2009，32(8):1270-1272.
　　[6] 国家药典委员会.中国药典（一部）[S].北京:化学工业出版社，2005:223.
　　[7] 王爱武，王梅，袁久荣， 等.猫爪草提取物体外抗肿瘤作用的研究[J].天然产物研究与开发，2004 ，16(6):529- 531.
　　[8] 詹莉，戴华成，杨治平，等.小毛茛内酯影响耐药结核患者外周血淋巴细胞SHSP和GLS表达的研究[J].中国中药杂志，2002，27(9):677.
　　[9] 吴守芝，宋俊峰. 结核分支杆菌致病机制与免疫[J]. 中华结核和呼吸杂志，2003，26 (2):101-103.
　　[10] Cole ST， Brosch R， Parkhill J， et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence[J]. Nature，1998，393 :537-544.转贴于