糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2的表达及对PG反应性的分析

【摘要】目的　观察糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体2（TLR2）的表达水平及其对肽聚糖（PGN）反应性的变化，探讨该变化在糖尿病机体防御病原体感染中的作用。方法　将32只Wistar雄性大鼠用随机数字表法分为正常组（A组），糖尿病组（B组），正常+ PGN组（C组）及糖尿病+ PGN 组（D组）。用免疫细胞化学方法、逆转录一聚合酶链反应(RT PCR)法检测各组大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达的变化。结果　B组及C组大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达与A组相比均明显增高（P&<0.05）；D组大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达较B组及C组升高更为明显，糖尿病与脂多糖刺激存在交互作用（P&<0.05）。结论　糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞TLR2表达明显增高，提示糖尿病机体处于促炎症状态，而且我们发现糖尿病与肽聚糖刺激在使TLR2表达增高方面存在交互作用。
【关键词】toll样受体2　糖尿病　肽聚糖
　　Toll样受体 (Toll2like receptors，TLRs)是近年来新发现的一种同源于果蝇Toll的蛋白分子，TLRs能够对病原体识别、结合、引发一系列信号间的转导，促进各种炎性介质的释放，在早期启动固有免疫应答 对宿主的天然免疫防御具有重要作用[1]。TL R与天然免疫应答关系的研究中，倍受关注的是 TL R2和 TL R4。近期人们对TLRs信号传导途径在糖尿病及其并发症的发生发展中所起的作用日渐重视[2]，但对于糖尿病感染患者TOLL受体的作用我们还知之甚少，此次实验我们研究了肽聚糖刺激下TLR2在正常大鼠及糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞表达，希望能进一步了解糖尿病病人免疫系统功能的变化。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　健康雄性Wistar大鼠32只，SPF级，鼠龄12周，体重（200±20）克，购于中国医科大学实验动物室，链脲佐菌素:美国sigama公司，PGN( staphylococcus aureus) : Sigma 公司， 谷氨酰胺、小牛血清FCS 、D 2Hanks液、RPM I1640: Hyclone 公司;兔抗鼠TLR2:美国SANTA CRUZ公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 将32支雄性Wistar大鼠随机分为4组：正常对照组（A组，n=8），糖尿病组（B组，n=8）， 正常＋PGN组（C组，n=8），糖尿病＋PGN组（D组，n=8）。
　　糖尿病组一次性腹腔注射链脲佐菌素60mg/kg体重，对照组注射同等剂量枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，72小时后随机血糖≥16.67mmol/L 为糖尿病模型成功，以后每周复查1 次血糖，连续观察4周[3]。
　　1.2.2 免疫细胞化学染色：采用免疫细胞化学染色SABC法，染色时兔抗鼠TLR2的浓度为1：200。阳性反应为胞膜和胞浆呈棕黄色着色。各组切片测定阳性细胞单位面积平均光密度值。
　　1.2.3 TLR2mRNA表达测定:引物委托上海生物工程服务有限公司合成，引物序列如下：上游引物5′-CTAAAGTCGATCCGCGACATC-3′，下游引物 5′-TTCATCAGTGAGAACCGAGC-3′，扩增长度为213bp(580–792)，内参照物β-actin引物:上游引物ACTGCCGCATGGTG TTCCTG，下游引物AA GCACTTGCGGTGCACGA。将Tripure试剂1mL加入培养皿中，以下步骤按照Tripure 试剂说明要求进行。逆转录—聚合酶链反应( RT—PCR) 严格按照试剂盒说明书进行操作。取各样本RT—PCR 产物10μL加样(β-actin5μL) 和1μL上清缓冲液混匀后加于2%琼脂糖凝胶电泳槽齿孔中，50V恒压电泳30min，取胶置凝胶成像系统中拍照，结果扫入电脑备处理。
　　1.2.4 统计分析：电泳条带比密度值以灰度×面积/参照物表示，采用SPSS13.0统计软件处理，实验数据用x-±s表示，各组间指标比较用双因素双水平析因分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1免疫细胞化学结果
　　A组大鼠肺泡巨噬细胞可见弱的TLR2表达，以胞浆及胞膜为主呈较淡的棕黄色改变（见图1）；B组细胞TLR2在上述部位表达渐增多，在胞浆及胞膜呈金黄色改变（见图2）；C组及D组细胞的胞浆及胞膜呈深棕黄色改变，且可见部分细胞胞浆淡染、肿胀，部分细胞胞核形态不规则，部分细胞变性坏死（见图3及图4）。
　　
　　2.2TLR2 mRNA表达变化 TLR2 和内参照物β–actin 扩增后的片段分别为293 bp、439 bp。与A组（0.113±0.017）相比，B组（0.211±0.06）、C组（0.331±0.04）、D组（0.495±0.019）的TLR2 mRNA 表达水平依次增加，差异显著（见图5）
　　
　　3 讨论
　　免疫系统保护我们免于自然界病原菌的侵害，Toll样受体在固有免疫中占据重要地位。目前其家族成员至少有11个[4]，其中 TL R2具有相对广泛的配体特异性 ，可识别多种病原体相关分子模式 (pathogen associated molecular patterns ， PAMPS)。近年来随着糖尿病人数日益上升，死于感染等并发症的也急剧增多，此次实验我们发现高血糖水平改变了Toll样受体的表达，在无PG刺激时TLR2在糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞表达较对照组增高；PG刺激后TLR2在糖尿病大鼠肺泡巨噬细胞的表达进一步增高，PG刺激与糖尿病在使TLR2表达升高方面存在交互作用，提示糖尿病机体处于促炎症状态，TLR2表达增加与糖尿病对炎症反应的失控关系密切，糖尿病人多发感染考虑与此有关，与此相同的是，Devaraj S[5]等证实糖尿病患者单核细胞中TLR2，TLR4的表达增加，及Mnhammad等［6］报道在新发病非肥胖型糖尿病大鼠骨髓巨噬细胞TLR2、TLR3、TLR4和TLR5升高，同时IL－12P40、NF-КB、IL-6及内源性NO均升高。
　　总之，糖尿病患者的免疫系统发生改变，Toll样受体在其中发挥着重要的作用，了解TLRs将可能对于糖尿病及其并发症的治疗及预防有重要的意义。
参 考 文 献
[1]Medzhitov R，Preston—Hurlburt P，Janeway CA． A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity．Nature，1997，388(6640):394-397．
[2]Kanczkowski W， Ziegler CG， Zacharowski K， Bornstein SR. Toll-like receptorsinendocrinedisease and diabetes.Neuroimmunomodulation.2008;15(1):54-60. Epub 2008 Jul 29[Epub ahead of print].
[3]SuthagarE，SoundamaniS，YuvarajS，etal.Effectsofstreptozotocin-induced diabetes and insulin replacement on rat ventral prostate.Biomed Pharmacother. 2008 Feb 11 [Epub ahead of print].
[4]杨芳芳，陈成水.Toll样受体2的研究进展[J].医学综述，2008，11:l4.
[5]Devaraj S，Dasu MR，Rockwood J，et al. Increased Toll-Like Receptor (TLR) 2 and TLR4 Expression in Monocytes from Patients with Type 1 Diabetes: Further Evidence of a Proinflammatory State.sJ Clin Endocrinol Metab. 2008 Feb;93(2):578-83.
[6]Mohammad MK， Morran M， Leaman DW， Dysregulated Toll-like receptor expression and signaling in bone marrow-derived macrophages at the onset of diabetesinthenon-obesediabeticmouse.IntImmunol，2006， 18(7):1101-13.