关于海人酸致痫大鼠海马CA3区神经元线粒体超微结构损伤的观察

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【摘要】 目的 观察海人酸（KA）诱导的癫痫持续状态（SE）大鼠海马CA3区线粒体超微结构的损伤。方法选用成年雄性Wistar大鼠40只，随机分为KA组和生理盐水对照组（NS组）。用KA诱导大鼠SE持续2 h，分别于SE终止后第1、3小时制作脑切片，采用光镜观察神经元的大体变化，并用电镜进一步观察线粒体的超微结构。结果 SE终止后3 h，大鼠海马线粒体出现了不同程度的损伤：从嵴的肿胀到膜的崩解。结论 KA诱导的SE在早期即可导致海马神经元线粒体的损伤，这可能是SE后神经元损伤的关键环节。
【关键词】 癫痫持续状态 神经元 线粒体 超微结构 大鼠 Wistar
［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the mitochondrial ultrastructure damage in the neurons of hippocampal CA3 area during kainicacid (KA)induced status epilepticus (SE) in rats. MethodsForty adult male Wistar rats were pided into two groups in random: KA group and control group. SE was induced for two hours. At the first and the third hour after termination of SE， rats were killed and the brain sections made. The gross changes of neuron were observed with light microscope， and the mitochondrial ultrastructure with electron microscope. ResultsThree hours after the end of SE， various damages of mitochondria， from swelling of cristae to rupture of membrane， were noted. ConclusionKainicacidinduced status epilepticus， in its early stage， may result in mitochondrial damage in the neurons of hippocampus， which might be the key link of neuronal lesion after status epilepticus.
　　［KEY WORDS］status epilepticus; neurons; mitochondria; ultrastructure; rats， Wistar
　　长久以来，人们一直认为，线粒体是真核细胞内的能量加工厂，其基本功能是通过氧化磷酸化以ATP的形式为细胞提供能量。与之相关的蛋白定位于线粒体内膜上，包括呼吸链的组成成分和腺苷转移酶。生化研究显示，脑内大多数ATP的消耗用于神经元的电活动，故来自线粒体的充足的能量供应对神经元的生存和功能很关键。癫痫持续状态（SE）是医学上的急症，可导致持久的神经元损伤，增加其后痫性发作的危险性。近年来，关于SE后线粒体超微结构改变的报道较少。本文用海人酸（KA）制作SE模型，观察海马CA3区神经元线粒体超微结构的损伤，以进一步探讨SE后神经元损伤的机制。
　　1 材料与方法
　　1．1 动物及分组
　　选用成年雄性Wistar大鼠40只，随机分为KA1、KA3组（分别为SE终止后1、3 h），每组10只，每一时点分别设10只鼠作为生理盐水对照组（NS1、NS3）。
　　1．2 SE模型的制作
　　向KA1、KA3组大鼠腹腔内注射KA（购自美国Sigma公司，10 mg/kg），同时向NS组大鼠腹腔内注射相同容量的生理盐水。观察大鼠出现痫性发作的时间和表现，并使之持续2 h，然后腹腔注射地西泮（10 mg/kg）以终止痫性发作。按照RACINE分级法，将动物痫性发作分为6级。0级：无惊厥；Ⅰ级：湿狗样颤动，面肌抽动、咀嚼；Ⅱ级：面部阵挛伴节律性点头；Ⅲ级：面部阵挛、节律性点头、前肢阵挛；Ⅳ级：前肢阵挛、后肢站立；Ⅴ级：失平衡、跌倒、四肢抽动、全身阵挛。
　　1．3 取材及标本制备
　　在SE后第1、3小时，用100 g/L水合氯醛 （3.6 mL/kg）将大鼠麻醉，剪开大鼠胸腔，将圆头针从大鼠心尖处插入，同时从右心耳处剪开心脏放血。先向心脏内快速推注生理盐水灌洗液（其量为灌注液的一半），直至从右心流出的液体变得清亮。然后立即向心脏内注射20 g/L戊二醛，其用量为：体质量（g）×7%×2，灌注速度为5～10 mL/min。注射完毕后立即断头，迅速取出双侧海马CA3区，置入30 g/L戊二醛中保存2 h，用PB液漂洗12～24 h，1 g/L四氧化锇后固定2 h，PB液漂洗30 min，常规乙醇、丙酮逐级脱水，Epon环氧树脂渗透包埋。
　　1.4 超微结构观察
　　1．4.1 半薄切片光学显微镜观察 用KBLⅢ型超薄切片机切取厚约1 μm的半薄切片，苏木精伊红染色后，用Olympus光学显微镜观察。
　　1．4.2 超薄切片透射电镜观察 用KBLⅢ型超薄切片机切取厚约75 nm的超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，用H800型透射电镜观察。参照FLAMENG分级标准，将线粒体损伤分为4级。0级：线粒体结构正常，有颗粒状沉淀物；1级：线粒体嵴和基质正常，但无颗粒状沉淀物；2级：基质颗粒消失，基质透明，无嵴破裂；3级：基质颗粒消失，基质普遍透明，嵴破裂；4级：基质颗粒消失，嵴普遍破裂，线粒体成空泡状。
　　每个样本随机取5个视野，计算每张照片中线粒体的数目和损伤的级数，取其平均值。
　　2 结　　果
　　2．1 大鼠行为学表现
　　KA1、KA3组大鼠均出现了典型的癫痫发作，其中14只大鼠为Ⅴ级发作，另6只为Ⅳ级，点燃率为100%。注入KA后出现痫性发作的时间为（15.3±4.6）min。NS1、NS3组大鼠无癫痫发作。
　　2．2 超微结构
　　光学显微镜观察显示，海马神经元排列整齐紧密，边缘清晰，胞浆透明，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，核仁清晰，形态正常。KA1、KA3组和NS1、NS3组大鼠的苏木精伊红染色结果无明显差异。
　　电镜观察显示，NS1、NS3组和KA1组大鼠线粒体结构完整、清晰，损伤分别为（0.22±0.03）、（0.23±0.05）和（0.26±0.13）级，3组间比较，差异无显著性（P&>0.05）。KA3组大鼠的线粒体结构模糊，嵴的肿胀明显，严重者伴随线粒体内外膜的崩解，损伤为（3.67±0.34）级，与NS3组和KA1组比较，差异均具有显著性（F=867.471，q=59.017～59.503，P&<0.01）。SE后3 h，细胞核结构完整，染色质呈颗粒状，核膜清晰，但线粒体已出现明显的肿胀，嵴消失。
　　3 讨　　论
　　近年来关于SE后神经元损伤的研究大多集中于细胞核，因为SE后细胞核出现典型的坏死或凋亡的特征［1，2］。本文实验显示，在SE后3 h即出现海马神经元线粒体的超微结构损伤，早于文献报道的细胞核的改变时间（24 h）。这一结果提示，线粒体的损伤可能是SE后神经元损伤的关键环节。

　　以往研究表明，SE诱导的神经元损伤是由NMDA受体介导的。SE发作后，突触后NMDA受体过度兴奋，Ca2+通道开放，导致细胞内Ca2+的大量聚集。根据兴奋毒性损伤的概念，细胞内高Ca2+是促进线粒体通透性转换孔（PTP）开放的重要因素［3］。PTP的开放使离子和呼吸链底物在线粒体基质和胞质之间达到平衡，导致线粒体跨膜电位的降低和线粒体基质的渗透性肿胀［4］。由于线粒体外膜具有比折叠的内膜小得多的表面积，线粒体外膜因此而断裂，引起细胞色素C的释放，并顺次激活caspase9和caspase3，之后caspase3进入细胞核，导致染色体DNA的阶段性降解。既往研究认为，caspase3的激活仅出现于神经元凋亡的过程中，但FUJIKAWA等［1］在不同的SE模型中观察到，电镜下神经元坏死的脑区出现了染色体阶段性降解的指标，提示神经元的坏死也是一个程序性的过程。NIQUIET等［5］用免疫电镜双标的方法在新生鼠海马神经元的低氧损伤模型中观察到，在神经元坏死的过程中也存在线粒体的损伤、细胞色素C的释放和caspase3的表达。提示线粒体的损伤、PTP的开放是导致神经元凋亡和坏死的共同通路［6］。
　　除caspase激活途径外，线粒体损伤亦可通过氧化应激的方式损伤神经元。目前有研究证实，在急性和慢性神经系统疾病中，由谷氨酸受体激活而产生的自由基在神经元死亡中发挥重要作用［7，8］。自由基是氧化磷酸化过程的毒性副产物，是不完全氧化的结果。痫性发作后，PTP的开放导致呼吸链的损伤和线粒体跨膜电位的降低，后二者可加速产生不完全的氧耗，减少ATP的形成，加剧自由基的过度产生。自由基可直接损伤所有的细胞结构，包括脂质、蛋白、DNA和线粒体膜结构。由于线粒体呼吸链的抑制，这可能导致恶性循环，最后导致氧化性细胞损伤。
　　本文实验还显示，在SE终止后3 h，苏木精伊红染色见神经元结构、形态正常，超微结构亦显示细胞核的结构基本完整，但线粒体有明显的损伤，提示线粒体的损伤发生于神经元死亡的上游。
　　综上所述，海马神经元线粒体超微结构的损伤与KA诱导的SE密切相关，线粒体的损伤是SE后神经元死亡的关键环节。线粒体与SE之间的联系为减轻SE后脑损伤提供了新的理论依据。

参考文献

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