作者：张泉三 董果雄 张社华
【摘要】 目的 探讨氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和生理浓度抗坏血酸对乙酰胆碱诱导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性及一氧化氮（NO）生成量的影响及其可能机制。方法 在培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中加入25、50、100 mg/L的oxLDL和生理浓度抗坏血酸作用24 h后，测定NO生成量、eNOS活性及细胞内谷胱甘肽（GSH）含量。结果 oxLDL以剂量依赖方式降低乙酰胆碱诱发的eNOS活性，减少NO的生成；生理浓度抗坏血酸改善eNOS活性，同时增加NO生成，差异均有显著性（F=50.075、48.400，q=3.773～19.998，P&<0.05、0.01）。而细胞内GSH的含量在oxLDL （50 mg/L）组与抗坏血酸组无明显差异。结论 oxLDL通过降低eNOS活性而减少NO的生成。生理浓度抗坏血酸通过直接影响eNOS活性而抑制该效应，此与其抗氧化作用无关。
【关键词】 脂蛋白类 LDL 抗坏血酸 内皮细胞 一氧化氮 一氧化氮合酶
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects and its mechanism of oxidized lowdensity lipoprotein (oxLDL) and Lascorbic acid of physiological concentration on endothelial nitric oxide synthase (eNOS) activity and nitric oxide (NO) production induced by acetylcholine in human umbilical vein endothelial cells. MethodsThe endothelial cells were incubated with Lascorbic acid (100 μmol/L) and subsequently exposed to different concentrations of oxLDL from 0 to 100 mg/L for 24 h at 37 ℃. NO production， eNOS activity， and level of glutathione were measured. ResultsoxLDL decreased eNOS activity and NO production in a dosedependent manner. Lascorbic acid at physiological concentration enhanced eNOS activity and NO production， with significant differences between the two groups （F=50.075， 48.400；q=3.773-19.998； P&<0.05，0.01）. However， level of glutathione in cell lysate was not changed between oxLDL (50 mg/L) group and Lascorbic acid group. ConclusionoxLDL may decrease NO production via attenuating NOS activity in HUVECs. Lascorbic acid at physiological concentration ameliorates eNOS activity without antioxidation.
［KEY WORDS］lipoproteins， LDL; ascorbic acid; endothelial cells; nitric oxide; nitric oxide synthase
近年来基础研究表明，一氧化氮合酶（NOS）以L精氨酸和分子氧为底物催化L精氨酸生成NO，而NO可以调节血管张力，抑制平滑肌细胞分裂，还可抑制血小板黏附和聚集［1］。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性降低及NO生成减少可导致内皮舒张功能障碍，它是动脉粥样硬化形成的重要环节。尽管影响NO生物活性的因素较多，但愈来愈多的研究表明，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）是导致动脉粥样硬化的重要因素之一，它对eNOS活性的影响是目前人们关注的热点。本研究观察了不同浓度oxLDL和生理浓度抗坏血酸对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）eNOS活性的影响，并探讨其可能的分子机制。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 HUVECs株购自北京医科大学肿瘤防治研究所。
1.1.2 试剂 LDL购自中国协和医科大学生化实验室；小牛血清、DMEM培养液，Hyclone公司生产；胰蛋白酶，GIBCO公司生产；NOS、NO、谷胱甘肽（GSH）测试盒，南京建成生物工程研究所生产；乙酰胆碱、L抗坏血酸均为国产试剂。
1.1.3 仪器 VU260紫外线分光光度计，日本岛津公司产品；可调型微量移液器，法国Gilson公司产品；超声细胞粉碎仪、恒温培养箱、超净工作台等均为国产仪器。
1.2 LDL的氧化修饰及修饰程度的鉴定［2］
将正常LDL放入0.01 mol/L的PBS中透析，去除离心制备过程中所加的抗氧化剂；然后用PBS溶液将LDL稀释至蛋白质量浓度为0.5 g/L；加入到新鲜配制的含10 μmol/L硫酸铜的PBS中37 ℃氧化12 h，然后在4 ℃含100 mg/L EDTA的PBS中透析24 h，以终止氧化修饰反应。将制备好的oxLDL以0.22 μm滤膜过滤除菌，置4 ℃保存备用。LDL氧化修饰程度用硫代巴比妥酸反应物质的含量来鉴定。
1.3 HUVECs株的培养
HUVECs株用含体积分数0.15小牛血清的DMEM培养液在37 ℃培养箱内培养3～5 d，待细胞融合后，用0.5 g/L胰蛋白酶与0.2 g/L EDTA进行消化。显微镜下观察到细胞收缩变圆时弃去消化液，加入培养液以终止胰蛋白酶作用。用滴管吹打壁上的细胞，使其完全脱落并分离。调整细胞浓度至3×108/L，接种于24孔板上培养。待细胞融合后，换用无血清无酚红DMEM培养液，然后即可进行实验。
1.4 实验分组及处理
实验分为5组，每组6份样品。对照组（①组）：只加入1 mL的培养液；25、50、100 mg/L oxLDL组（②、③、④组）：分别加入相应浓度的oxLDL各1 mL；抗坏血酸组（⑤组）：先加入100 μmol/L的L抗坏血酸1 mL预处理24 h，然后再加入50 mg/L的oxLDL 1 mL。以上各组在测试前1 h分别加入1 μmol/L的乙酰胆碱。
1.5 测定指标及方法
1.5.1 NO NO-2及NO-3为NO的稳定代谢产物，已被证实为指示NO产生水平的优良指标。分别收集各组细胞培养液，按照NO测试盒说明书操作测定NO-2及NO-3的含量。
1.5.2 NOS活性 NOS催化L精氨酸和分子氧反应生成NO，NO与亲和性物质生成有色化合物，在530 nm波长下测吸光度，根据吸光度的大小，计算出NOS活力。操作按试剂盒说明书进行。
1.5.3 GSH 用超声细胞粉碎仪将内皮细胞粉碎、离心，取上清，应用比色法测定GSH的含量。操作按试剂盒说明书进行。
1.6 统计学分析
所有实验数据以±s表示。多组数据比较用方差分析，相关性采用直线回归分析，两组均数比较采用小样本t检验。
2 结 果
②、③、④组eNOS活性及NO含量均低于①组，差异有显著性（F=50.075、48.400，q=4.403～19.998，P&<0.05、0.01）。且随着oxLDL浓度的增加eNOS活性逐减，NO生成量逐渐减少，差异有显著性（q=3.773～14.144，P&<0.05、0.01）。与③组比较，⑤组eNOS活性显著增强，同时NO含量则明显增加，差异有显著意义（q=6.757、9.767，P&<0.01）。见表1。直线相关分析显示，eNOS活性与NO含量之间呈正相关（r=0.984，P&<0.01）。⑤组细胞内GSH的含量为（18.40±2.32）mg/L，而③组其含量为（18.06±3.39）mg/L，两组比较，差异无显著性(t=1.785，P&>0.05)。表1 不同浓度的oxLDL对内皮细胞NO生成量及eNOS活性的影响
众所周知，LDL被氧化修饰后，理化性质发生了一系列的改变，生成大量的脂质过氧化物，卵磷脂转化为溶血卵磷脂，同时内皮细胞膜上LDL受体识别位点发生改变，产生oxLDL的自身结合位点。SAWAMURA等［3］在1997年克隆出了oxLDL的特异内皮受体即血凝素样oxLDL受体（LOX1），并发现该受体能特异识别摄取oxLDL，推测这一特征对内皮依赖舒张功能有损害作用，其机制与内皮细胞NO量的生成减少或NO灭活增加有关。其他研究发现，oxLDL能抑制缓激肽诱发的牛主动脉内皮细胞释放NO，且该作用随着oxLDL浓度增加而增强［4］。从oxLDL中提取的脂质成分对NO的抑制效应与oxLDL作用相当，而oxLDL的蛋白成分并无此作用，提示oxLDL对NO的失活作用决定于其中的脂质成分。另外，oxLDL对NO的影响还在于抑制NO的合成。LIAO等［5］研究表明，oxLDL可明显地低内皮细胞eNOS的活性及其基因的表达，从而减少内皮源性NO的产生。OHARA等［6］研究表明，oxLDL能使体内氧自由基生成增加从而影响eNOS的活性。本文研究了oxLDL对激动剂乙酰胆碱诱发的内皮细胞NO生成的影响，结果显示，随着oxLDL浓度的增加而eNOS活性逐渐减弱，NO含量逐渐减少，呈剂量依赖性效应，说明NO生成减少至少部分是由eNOS活性降低所致。本文结果还表明，给予生理浓度的抗坏血酸后，细胞内GSH的含量未见明显的改变，而eNOS活性与NO之间则呈直线相关性，这进一步说明了生理浓度的抗坏血酸促进NO的生成并非是由于其抗氧化作用所致，而可能系直接作用于eNOS的结果。
最新研究认为，L抗坏血酸以剂量依赖的方式促进激动剂诱导的内皮细胞NO的生成，这可能是通过改善eNOS辅助因子四氢生物喋呤（BH4）的利用度或亲和力而发挥作用［7］。其依据为：①在缺乏BH4的条件下抗坏血酸促进NO生成的作用明显降低，它以BH4剂量依赖性方式提高NO生物活性。②抗坏血酸不能诱导eNOS mRNA及其蛋白的表达。③抗坏血酸也不能增加BH4的合成。④与增加L精氨酸无关，因为抗坏血酸不增加其胞内摄入。⑤应用抗坏血酸后细胞内GSH无明显改变。进一步研究发现，在抗坏血酸中烯二醇结构是该作用所必需的。由此可见，生理浓度的抗坏血酸能直接增强eNOS活性，促进NO生成，从而改善内皮细胞功能障碍。
综上所述，oxLDL对eNOS活性及NO生成的抑制作用呈剂量依赖效应。抗坏血酸能直接增强eNOS活性。推测oxLDL对eNOS有直接的损害作用，其机制可能与其降低BH4的利用度或亲和力，或者与促使eNOS二聚体解偶联有关［8］，但详细的机制有待于进一步研究。
参考文献
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［2］STEINBRECHER U P S， PARTHASARATHY D S， LENKE J L，et al. Modification of low density lipoprotein by endothelial cells involves lipid peroxidation and degragation of low density lipoprotein phospholipids ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1984，81:38833887.
［3］SAWAMURA T， KURNE N ， AOYAMA T， et al . An endothelial receptor for low density lipoprotein ［J］. Nature， 1997，386(6):7376.
［4］CHIN J H， AZHAR S， HOFFMAN B B， et al. Inactivation of endothelial derived relaxing factor by oxidized lipoproteins［J］. J Clin Invest， 1992，89:1018.
［5］LIAO J K， SHIN W S， LEE W Y， et al. Oxidized low density lipoprotein decreases the expression of endothelial nitric oxide synthase ［J］. J Biol Chem， 1995，270:319324.
［6］OHARA Y， PETERSON T E， HARRISON D G. Oxidized low density lipoprotein increases endothelial; superoxide anion production ［J］. J Clin Invest， 1993，91:25432551.
［7］HUANG A， VITA J A， VENEMA R C， et al. Ascorbic acid enhances endothelial nitric oxide synthase activity by increasing intracellular tetrahydrobiopterin ［J］. J Biol Chem， 2000， 275(23):1739917406.
［8］STROES E S G， VAN FAASSEN E E， YO M， et al. Folic acid reverts dysfunction of endothelial nitric oxide synthase ［J］. J Circ Res， 2000， 83:11291134.