关于PTEN基因在原发性肝细胞癌中的表达

【摘要】 目的 探讨PTEN基因变异在原发性肝细胞癌(HCC)发生发展中的作用。方法 应用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术，对30例肝癌组织、30例癌旁组织和16例正常肝组织细胞中PTEN基因的表达情况进行了检测和分析。结果 肝癌组织中PTEN基因表达水平明显低于癌旁组织和正常肝组织（F＝6.785，q=4.269、4.549，P&<0.05）。低分化肝癌组织中PTEN基因表达水平显著低于高、中分化肝癌组织 (t=3.266，P&<0.01)。结论 PTEN基因失活与肝癌发生密切相关；PTEN基因表达水平与HCC恶性程度有明显相关性，提示其变异可以作为病人预后判断的指标。
【关键词】 基因 PTEN RNA 信使 癌 肝细胞 逆转录聚合酶链反应
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the role of PTEN variation in the pathogenesis of hepatocellular carcinoma (HCC). MethodsSemiquantitive reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) was adopted to detect the expression of PTEN gene in 30 HCC and their adjacent tissues as well as 16 normal liver tissues served as controls. ResultsThe expression level of PTEN gene in the HCC tissues was significantly lower than that in the adjacent and normal liver tissues （F＝6.785;q=4.269，4.549;P&<0.05）. In lowlydifferentiated HCC tissue， the expression of PTEN was much lower than that in the highly and moderatelydifferentiated HCC tissues (t=3.266，P&<0.01).ConclusionThe inactivation of PTEN is closely associated with the pathogenesis of hepatocellular carcinoma， and the expression of PTEN is highly related with the malignancy of the cancer， which suggests that the alternation of PTEN can serve as a prognostic predictor for this disease.
　　［KEY WORDS］gene， PTEN; RNA， messenger; carcinoma， liver cell; reverse transcriptase polymerase chain reaction
　　原发性肝细胞癌(HCC)是一种高发性恶性肿瘤，其发生发展涉及多基因、多分子水平的改变。 PTEN基因又称MMAC1或TEP1，是一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN蛋白在细胞的生长发育、信号传导、迁移、凋亡过程中起到重要作用。PTEN基因的突变和失活存在于多种肿瘤中，如神经系统、生殖系统及消化系统肿瘤等。国外有学者研究发现，肝癌组织中存在着PTEN基因的突变［1］，国内学者用免疫组化方法检测了PTEN蛋白在肝癌中的表达，发现肝癌组织中存在较高比例的PTEN蛋白的阴性表达［2］。目前，有关PTEN的研究集中于基因的缺失和突变，而对于基因的表达则研究得较少。本研究应用半定量RTPCR技术从mRNA水平检测PTEN基因在肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达情况，分析PTEN基因失活在肝癌发生中的作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　标本来自2001年12月～2002年12月青岛大学医学院附属医院及青岛市市立医院肝胆外科手术病人。30例HCC病人（HCC组），男22例，女8例，年龄33～71岁，平均52岁。术中取癌区、癌旁区（距癌边缘2～5 cm）组织标本。16例肝血管瘤手术病人为正常对照组（CON组），其中男11例，女5例，年龄35～59岁，平均52岁。术中取正常肝组织标本。所有标本均经病理学检查证实。
　　1.2 方法
　　1.2.1 组织总RNA提取及RTPCR检测PTEN表达 用Trizol法提取组织总RNA，水溶后将其反转录合成cDNA。PTEN基因引物如下。外显子1：5′CGA AGC TTC CAC CAT GAC CAT CAT CAA AG3′；外显子5：5′ATC AAA CCC TTT TGT GAA GA3′；外显子8：5′TCT ATA CTG CAA ATG CTA TC3′；外显子9：5′TTG GAT CCT CAG ACT TTT GTA ATT3′。分别以外显子1、5为上游引物，8、9为下游引物，进行18、19、58、59四种组合，用RTPCR法检测PTEN基因 不同片段在肝癌中的阳性表达率及表达水平。以甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参照（上游引物5′CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA3′；下游引物5′ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA3′）［3］。PCR反应体积为25 μL，反应体系为10×Buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L ， dNTP 0.1 mmol/L， Tap DNA聚合酶1.0 U，PTEN及GAPDH上下游引物各0.4 μmol/L，cDNA模板2 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，33个循环；72 ℃延伸10 min。
　　1.2.2 PCR产物定量及分析 取10 μL扩增产物于含EB（0.5 mg／L）的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，用DL2000作为分子质量标准，紫外线透射仪观察结果并拍照。用激光密度扫描仪扫描电泳条带，采用德国欧波同公司VIDAS图像分析系统计算电泳条带吸光度值，作为PCR产物相对含量。用PTEN吸光度与GAPDH吸光度的比值表示PTEN基因的相对表达量，比较PTEN基因在肝癌、癌旁组织和正常肝组织中表达水平的差异，以及PTEN表达水平与其他一些临床病理因素的关系。
　　1.2.3 统计学处理 采用χ2检验、方差分析及t检验。
　　2 结　　果
　　2.1 PTEN基因PCR产物电泳
　　肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中PTEN基因各片段与GAPDH 同时扩增，PCR产物电泳结果见图1～4。外显子19扩增片段长度为1 233 bp，59为920 bp，58为620 bp，18为933 bp。另外，GAPDH扩增片段长度为450 bp。
　　2.2 PTEN基因表达水平的比较
　　30例肝癌组织中，有26例检出PTEN基因的 表达，检出率为86.7%，有3例同时出现引物19、59缺失，1例发现引物18、19、58、59 RTPCR扩增产物缺失现象，癌旁组织及16例正常肝组织中PETN基因全部表达，肝癌组织与癌旁组织、正常肝组织间PTEN阳性表达率比较，差异无显著性（χ2＝1.073， P&>0.05）。
　　肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中PTEN基因表达水平（PTEN/GAPDH比值）分别为1.619±0.407、1.302±0.343、1.232±0.386。肝癌组织与癌旁组织及正常肝组织比较，差异有显著性（F＝6.785，q = 4.269、4.549，P&<0.05），而癌旁组织与正常肝组织比较，差异无显著意义（q=0.823，P&>0.05）。
　　2.3 PTEN基因表达水平与部分临床病理因素的关系
　　低分化肝癌PTEN基因表达水平显著低于高、中分化肝癌；PTEN基因表达水平与有无肝内转移卫星灶及病人的年龄、性别无显著相关性。见表1。表1 PTEN基因表达水平与部分临床病理因素的关系
　　3 讨　　论
　　HCC是我国高发而且病死率极高的一种恶性肿瘤，其发病机制尚不清楚，在HCC发生过程中，多种原癌基因激活和抑癌基因失活，导致其编码的蛋白质发生质和量的改变，从而引起细胞的恶变。因此，对抑癌基因的研究在探索肿瘤发生发展的分子生物学机制方面有重要的意义。PTEN基因位于10q23.3，是第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，该基因的突变失活与人类大多数肿瘤如卵巢上皮样癌、乳癌、前列腺癌、黑色素瘤等的发生发展密切相关［4］。肝细胞癌10q杂合性缺失频率达33% 左右，提示HCC中PTEN基因可能发生突变失活［5］。研究PTEN基因在HCC发生中的作用，有助于进一步阐明HCC发生的分子机制。

PTEN基因突变在神经系统等恶性肿瘤中突变率较高，但是在大多数肿瘤中突变率是不高的。如在前列腺癌中有中度突变率，而在乳腺、甲状腺、膀胱、肺及血液系统的恶性肿瘤中突变率较低。然而PTEN在多数肿瘤中有失表达或表达减少的情况，提示除了突变和缺失，PTEN还有其他一些失活机制，导致其在mRNA和蛋白水平上低表达或表达缺失。本研究在以往研究的基础上，使用半定量RTPCR法，从mRNA水平检测了PTEN基因在肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织中的表达情况。较免疫组化法而言，RTPCR法步骤简单，在一定程度上可弥补后者能够引起假阴性的不足。本文结果显示，在肝癌组织中PTEN mRNA的阳性表达率为86.7%，癌旁组织及正常肝组织中PTEN mRNA阳性表达率均为100%，三种组织间差异无显著性。将不同组织中表达的mRNA进行半定量分析，结果表明PTEN mRNA在癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织及正常组织， 提示PTEN表达水平降低与HCC发生密切相关，与以往的研究结果相符［6］。本研究还分析了PTEN基因表达水平与部分临床病理因素的关系，发现PTEN表达水平与病人的年龄、性别及肝内转移卫星灶无显著的相关性，而与肝癌分化程度密切相关。一般认为HCC的分化程度是一个较好的预后判断指标，因此，肝癌组织中PTEN mRNA表达水平对于判断预后及指导治疗用药有一定的参考意义。

【

参考文献

】
［1］ZHANG L， YU Q， HE J， et al. Study of the PTEN gene expression and FAK phosphorylation in human hepatocarcinoma tissues and cell lines［J］. Mol Cell Biochem， 2004，262(12):2533.

［2］万兴旺， 王红阳， 江明，等. 抑癌基因PTEN在原发性肝癌中的表达及意义［J］. 中华肝脏病杂志， 2003，11(8):490492.

［3］SHARRARD R M， MAITLAND N J. Phenotypic effects of overexpression of the MMAC1 gene in prostate epithelial cells［J］. Br J Cancer， 2000， 83(8):11021109.

［4］张辉， 戴淑真， 罗兵，等. 卵巢上皮性癌组织中PTEN mRNA的表达［J］. 青岛大学医学院学报， 2003，39(4)：418420.

［5］MAEHAMA T， DIXON J E. The tumor suppressor， PTEN/MMAC1， dephosphrylates the lipid second messenger， phosphatidylinositol 3，4，5triphosphate［J］. J Biol Chem， 1998， 273:1337513378.

［6］HU T H， HUANG C C， LIN P R， et al. Expression and prognostic role of tumor suppressor gene PTEN/MMAC1/TEP1 in hepatocellular carcinoma ［J］. Cancer， 2003， 97(8):19291940.