关于2，3吲哚醌对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞增殖影响

【摘要】 目的 研究2，3吲哚醌对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞增殖的影响。方法 应用MTT比色法观察2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞生长的抑制情况；流式细胞仪检测2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞周期分布的影响；Western blot方法观察其对细胞信号传导通路蛋白有丝分裂原激活的蛋白激酶（ERK）的作用，同时结合免疫细胞化学方法检测2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞caspase3的影响。结果 2，3吲哚醌能显著抑制SHSY5Y细胞增殖，并使细胞周期阻滞于G0/G1期；caspase3蛋白表达随着药物浓度的升高逐渐增加;加2，3吲哚醌后磷酸化的有丝分裂原激活的蛋白激酶蛋白(ERK1/2)相对表达量降低。结论 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞具有抗增殖作用，其作用可能是通过诱导细胞凋亡、改变细胞周期以及作用于细胞通路而实现的。
【关键词】 2 3吲哚醌 细胞增殖 神经母细胞瘤
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the antiproliferation effects induced by 2，3dioxoindoline on SHSY5Y cells. Methods MTT method was used to examine the effects of 2，3dioxoindoline on the proliferation of SHSY5Y cells， and flow cytometry to determine the cell cycle. Western blot was employed to assay the change of the key protein， ERK in the cell signal transmission way. The activity of caspase3 in the SHSY5Y cells was assayed by immunohistochemical technology. Results2，3dioxoindoline was found to inhibit the proliferation of SHSY5Y cells， and disturb the distribution of cell cycle by increasing cell population in G0/G1 phase and decreasing in S phase. The expression of caspase3 protein was intensified and positively related to the dosage of 2，3dioxoindoline. And the cell signal transmission way was also affected.Conclusion2，3dioxoindoline can inhibit the proliferation of SHSY5Y cells. The mechanism of its antiproliferation effects is possibly related to the change of cell cycle， the prevention of the signal transmission and the upregulation of caspase3 protein in tumor cells.
　　［KEY WORDS］2，3dioxoindoline； cell proliferation； neuroblastoma
　　随着长春碱、长春新碱在临床上的应用，吲哚类化合物的抗肿瘤作用日益引起人们的关注［1］。吲哚醌系天然存在于自然界的吲哚类化合物，是维持龙虾存活所必需的一种天然抗生长活性物质［2，3］，也存在于人体内及中药大青叶中。近年来的许多研究证实，吲哚醌对多种实体肿瘤细胞具有较强的杀伤和抑制作用［4］，但至今其单独作用于人神经母细胞瘤的报道少见。本研究观察2，3吲哚醌对人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株生长的抑制作用，现将结果报告如下。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料及其来源
　　SHSY5Y细胞株购自中国协和基础学院细胞中心。RPMI 1640培养基购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；四唑氮蓝（MTT）为Sigma公司生产；2，3吲哚醌购自上海元吉化工有限公司，实验时使用RPMI 1640溶解并过滤除菌。caspase3一抗、SP试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司。牛血清清蛋白（BSA）购自Amresco公司。兔抗人有丝分裂原激活的蛋白激酶(ERK) 抗体购自武汉博士德生物工程公司。过氧化物酶标记的驴抗兔抗体购自Amersham pharmacia biotech。
　　1.2 方法
　　1.2.1 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞形态影响的观察 将对数生长期的SHSY5Y细胞消化后，调整细胞浓度为109/L，接种于培养瓶中。37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下孵育36 h后换新培养液，并加入2，3吲哚醌，使其终浓度分别为0、100、200、400 μmol/L，培养48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态的变化。
　　1.2.2 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞的生长抑制作用检测 采用MTT比色法［5］。取对数生长期的SHSY5Y细胞，调整细胞浓度为108/L，接种于96孔板中，每孔细胞数1×104个，接种36 h后换新培养液，实验组加入2，3吲哚醌，使其终浓度分别为50、100、200、400 μmol/L，同时设立空白对照组（不加2，3吲哚醌，加入等体积的RPMI 1640培养液）。每孔体积为200 μL，每个浓度设12个复孔，分别培养24、48、72 h后，每孔加入新鲜配制的MTT（10 g/L）10 μL，继续培养4 h后，去除培养液，每孔加入100 μL DMSO溶解结晶30 min，用自动酶标仪（Rayto 2100C酶标仪）于490 nm处测定吸光度值。重复3次，取平均值，计算细胞生长抑制率。
　　1.2.3 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞周期影响的检测 取铺满瓶底的SHSY5Y细胞，去掉原液，加入新的细胞培养液准确调至5 mL。24 h后分别加入0、100、200、400 μmol/L浓度2，3吲哚醌，作用48 h后收集细胞，调整细胞浓度为(0.5～1.0)×109/L。将细胞悬液离心，弃上清，分别加入碘化丙啶（PI）作用30 min，然后，用流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）进行细胞周期分析，每个样本分别约检测11 000个细胞，计算各期细胞数占细胞总数的百分率。
　　1.2.4 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞caspase3蛋白表达影响的检测 采用免疫细胞化学SP技术，取经100、200、400 μmol/L 2，3吲哚醌诱导的SHSY5Y细胞，以未经处理的细胞作为对照。分别用40 g/L多聚甲醛固定，按SP试剂盒说明操作，其中caspase3一抗效价为1∶50。光学显微镜下观察并判断结果，细胞染色呈棕褐色或棕黄色为阳性。caspase3蛋白定位于胞浆，也可见于胞核。连续观察5个高倍视野，计算阳性细胞百分率。
　　1.2.5 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞信号传导蛋白ERK的影响 取4瓶经0、100、200、400 μmol/L 2，3吲哚醌诱导的SHSY5Y细胞，细胞总蛋白的提取及Western blot 检测参照文献［6］方法。35 μg的SHSY5Y细胞蛋白经SDSPAGE 电泳，转膜后置于含体积分数0.01牛血清清蛋白中封闭， 4 ℃过夜， 加入一抗（抗ERKs，即抗p42或p44有丝分裂原激活的蛋白激酶，1∶500稀释），4 ℃孵育12 h ，TBS清洗， 再与二抗(过氧化物酶标记的驴抗兔抗体，1∶1 000稀释)作用，置于摇床上孵育4 h，TBS清洗。化学发光剂室温作用1 min，暗室中予X线曝光显影。采用Kodak图像分析系统对X线照片上的蛋白带进行扫描和半定量分析。
　　1.3 统计学处理
　　采用SPSS 11.0统计软件进行方差分析。
　　2 结　　果
　　2．1 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞形态的影响
　　2，3吲哚醌作用48 h后的SHSY5Y细胞失去正常的三角形，伪足消失，细胞变圆变小，贴壁细胞数目减少，部分脱落于培养液中，并且浓度越高，上述表现越明显，漂浮细胞越多。
　　2．2 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞生长抑制率的影响
　　2，3吲哚醌能够抑制SHSY5Y细胞增殖，其作用具有剂量依赖性，差异有显著性。见图1。
　　图1 不同浓度2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞的生长抑制率比较
　　2．3 2，3吲哚醌对细胞周期的影响
　　400 μmol/L组2，3吲哚醌处理48 h后G0/G1期（细胞静止期和DNA合成前期）比例高于其他3组，S期和G2/M期低于其他3组，差异均有显著性（F=17.29～48.01，q=7.12～19.87，P&<0.05）；200 μmol/L组的3项指标与其他3组比较，差异均有显著性（q＝3.04～15.96，P&<0.05）。见表1。
　　2.4 2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞caspase3蛋白表达的影响
　　对照组、2，3吲哚醌100、200、400 μmol/L组caspase3蛋白阳性细胞数分别为（15.8±5.4）%、（25.6±8.2）%、（26.8±10.1）%、（28.9±12.1）%，加药组SHSY5Y细胞中caspase3蛋白阳性细胞数较对照组明显增多，差异有显著意义（F=25.65，q＝10.29，P &<0.05）。随着2，3吲哚醌剂量的增加，其表达量有明显增多的趋势。
　　2.5 2，3吲哚醌作用后磷酸化的有丝分裂原激活的蛋白激酶蛋白（ERK1/2）相对表达情况400 μmol/L不同浓度2，3吲哚醌组ERK1/2相对表达量分别为（81.43±5.42）%、（79.94±6.23）%、（79.01±9.12）%。 100、200、400 μmol/L 2，3吲哚醌组ERK1/2相对表达量较对照组降低，但是2，3吲哚醌各组之间差别无统计学意义。表1 不同浓度2，3吲哚醌组SHSY5Y细胞周期分布比较
　　3 讨　　论
　　近年来，吲哚类化合物抗肿瘤作用正在引起人们越来越多的重视，尽管越来越多的吲哚类化合物被证明有抗肿瘤作用，但其抗肿瘤的机制尚未明了。本课题以人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞作为目的细胞株，研究2，3吲哚醌对其生长的抑制作用，并初步探讨了2，3吲哚醌诱导凋亡的作用。结果显示，2，3吲哚醌能明显抑制SHSY5Y细胞增殖，并在一定浓度范围内（50～400 μmol/L）随其浓度增加而抑制作用明显增强，呈浓度依赖效应。
　　已有的研究证实，在细胞增殖周期中，G0/G1期、S期和G2/M期之间存在着影响细胞周期进行的调控点，而药物可能通过影响这些调控点来影响细胞的增殖，不同的药物可影响细胞周期的不同阶段［7，8］。本研究检测了2，3吲哚醌对SHSY5Y细胞周期分布的影响，结果显示，2，3吲哚醌能使细胞阻滞于G0/G1期，进入S期和G2/M期的细胞比率降低，并呈浓度依赖性。S期是细胞DNA合成期，S期细胞比率降低说明2，3吲哚醌可导致肿瘤细胞DNA合成障碍，干扰肿瘤细胞蛋白质代谢，抑制肿瘤生长，进一步证明了2，3吲哚醌能够改变细胞周期分布进而抑制细胞增殖。
　　凋亡发生机制中最关键的环节之一是caspase的激活。caspase为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，而且是在细胞凋亡中起作用的一组同源性蛋白， caspase3是其中最重要的细胞凋亡执行者之一。caspase3的活化在细胞凋亡信号转导过程中起核心作用，是细胞凋亡过程中激活的关键蛋白激酶和主要效应因子。大多数触发细胞凋亡的因素，均需通过caspase3介导的信号传导途径导致细胞凋亡［9］。正常状况下，细胞中的caspase3并无活性，以酶原的形式存在。当细胞受到凋亡信号刺激时，它被系列反应激活继而诱导细胞发生凋亡［10］。本文结果显示，2，3吲哚醌可增加caspase3蛋白表达，这可能是2，3吲哚醌诱导SHSY5Y细胞凋亡的一条途径。

转贴于 　　肿瘤的发生涉及到多种细胞事件及生理过程，而细胞内信号传导通路与肿瘤发生发展密切相关。其中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路是细胞内重要的存活信号通路。已有证据显示，MAPK信号转导通路的异常与多种肿瘤或增殖性疾病关系密切，其中ERK1/2是MAPK传导通路中的重要枢纽，它主要介导来自生长因子的信号传递，与细胞的增殖分化有关。ERK是Ras/Raf/MEK/ERK1/2信号传递通路上与细胞核最为靠近的成员， 属于MAPK家族，正常及恶性细胞受到某些外界刺激后，可通过磷酸化激活ERK1/2， 使之由胞质转位到核内， 进而介导Elk1、ATF、NFJB、 Ap1、 cfos、cjun的转录活化，诱导某些基因的开放表达，最终导致细胞的异常增殖甚至肿瘤的发生，并参与细胞分化和凋亡等多种生物学反应［11］。由此可见，下调ERK活性将有助于抑制癌细胞的增殖和促进癌细胞的凋亡。本文用Western blot方法检测了加2，3吲哚醌前后活化的ERK1/2的表达，结果显示，加2，3吲哚醌后SHSY5Y细胞中其相对表达水平明显下降。鉴于此，我们推断2，3吲哚醌抑制SHSY5Y细胞增殖的机制之一，可能与其对ERK传导通路的抑制有关。
　　本文应用SHSY5Y细胞株作为靶细胞，研究2，3吲哚醌对肿瘤细胞增殖的影响，并初步探讨了其诱导凋亡作用，具有理论和实际意义。2，3吲哚醌可通过caspase3途径及其对细胞通路的影响诱导细胞凋亡。在2，3吲哚醌诱导SHSY5Y细胞凋亡的过程中可能还涉及其他的机制，2，3吲哚醌能否成为新一代的凋亡诱导剂尚需进一步的探讨。

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