关于乌鸡白凤丸对Aβ140诱导的大鼠海马神经元凋亡的保护作用

【摘要】 目的 研究乌鸡白凤丸（BFP）对β淀粉样蛋白140（Aβ140）诱导体外培养大鼠海马神经元凋亡的保护作用以及可能的作用机制。方法 体外培养新生Wistar大鼠海马神经元，MTT法检测不同浓度Aβ140的细胞毒作用，选择出现显著细胞毒性的剂量为使用剂量。同时给予BFP（100 mg/L）干预。用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡情况，用半定量RTPCR技术检测凋亡相关基因bcl2、bax和caspase3基因mRNA的表达水平。结果 10 μmol/L Aβ140与海马神经元共孵育24 h有明显的细胞毒作用，并可诱导神经元凋亡，加入BFP干预后凋亡指数降低。Aβ140可使bcl2基因表达下调，bax基因表达上调，caspase3基因的表达增强。加入BFP干预后，部分拮抗了Aβ140诱导的bcl2基因的表达变化，从而使caspase3基因的表达降低。结论 BFP可通过调控bcl2/bax的比值、降低caspase3基因mRNA的表达来阻断Aβ140所诱导的海马神经元凋亡，具有神经保护作用。
【关键词】 乌鸡白凤丸 淀粉样β蛋白 细胞凋亡 海马 神经元 基因 bcl2 基因 bax 基因 caspase3
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the protective effects of Bak Foong Pills (BFP) on apoptosis of cultured hippocampus neurons induced by Aβ140， and to explore the possible mechanism. MethodsNeurotoxicity was measured by MTT method among the cultured hippocampus neurons treated with Aβ140 in different concentrations (0.1 to 30 μmol/L). Certain concentration of Aβ140， which induced the excessive apoptosis of neurons， was determined. Meanwhile， BFP was applied to produce the antiapoptosis effect. Apoptosis was manifested by TUNEL straining， and the expression levels of bcl2， bax and caspase3 were analyzed semiquantitatively by RTPCR. ResultsSignificant neurotoxicity was observed after the neurons being incubated with 10 μmol/L Aβ140 for 24 h，and then the dose was determined in the study. Excessive apoptosis was observed among the neurons under the same condition， such as downregulation of bcl2 expression and upregulation of bax expression. The apoptotic index (bcl2/ bax) was reduced， too， which enhanced the expression of caspase3. Combination of BFP with Aβ140 partially corrected the downregulation of bcl2 expression. The ratio of bcl2/bax was increased and the expression of caspase3 reduced.Conclusion The neuroprotection of BFP might be realized by blocking the apoptosis of hippocampus neurons induce by Aβ140， by modulating the ratio of bcl2/bax and reducing the expression of caspase3.
　　［KEY WORDS］Bak Foong Pills； amyloid betaprotein； apoptosis；hippocampus； neurons； genes， bcl2； genes， bax； genes， caspase3
　　阿尔茨海默病(AD)是一种渐进性神经系统病变，其病理改变除经典的老年斑和神经元纤维缠结之外，还有神经元的丢失。近来的研究显示，AD神经元的丢失主要表现为凋亡［1］。目前多数学者认为，β淀粉样蛋白(Aβ)在脑组织中的积聚和沉积是各种原因诱发AD的共同通路，也是AD形成和发生的关键因素。虽然认为Aβ的神经毒性是多因素造成的，但一些证据表明，Aβ诱发的细胞凋亡可能是AD认知功能障碍的原因［2］。研究表明，雌激素替代疗法可降低或延缓AD的发生［3］。类雌激素药物乌鸡白凤丸(BFP)是一种用于治疗妇科疾病的传统中药，并可用于缓解多种神经退行性疾病，如AD和PD等。本室研究结果显示，BFP可对Aβ140导致的PC12细胞损伤具有保护作用［4］。本研究用毒性剂量的β淀粉样蛋白140（Aβ140）诱导体外培养的原代海马神经元，建立AD细胞模型，并给予已证实有效剂量BFP（100 mg/L）进行干预，应用原位免疫组化、RTPCR等技术和手段，从细胞和分子水平探讨Aβ诱导神经毒性的可能途径，以及BFP阻断由Aβ 诱导的神经元凋亡的作用及途径，为临床用药防治AD提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试剂
　　Aβ140系Sigma公司产品。用9 g/L NaCl溶液配制成100 μmol/L母液，滤过除菌，-20 ℃贮存。实验前37 ℃孵育7 d使其变为聚集状态的Aβ140。BFP由香港中文大学陈小章教授提供，用9 g/L的NaCl溶液配制成6 g/L母液，滤过除菌，-20 ℃贮存。DMEM/F12培养基、胎牛血清、马血清、胰酶均购自Gibco公司；MTT购自美国Sigma公司。AMV Reverse Transcription System Kit、PCR试剂购自美国Promega公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；in situ Cell Death Detection Kit (TUNEL POD)购自ROCHE公司。
　　1.2 实验动物
　　新生24 h的Wistar大鼠购自青岛市药检所动物实验中心。
　　1.3 大鼠海马神经元的原代培养
　　按已有的细胞培养方法，取新生不超过24 h的Wistar大鼠，无菌操作分离出双侧海马，在解剖显微镜下剔除脑膜和血管。用预致冷的解剖液冲洗干净，剪碎成大小1 cm×1 cm×1 cm的组织块，加入1.25 g/L胰酶2 mL，放入37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中消化3～5 min。用含有体积分数0.10的胎牛血清及体积分数0.10的马血清的种植培养液终止胰酶的作用。去掉上清液，加培养液轻轻吹打，制成1×108/L的细胞悬液，种到6孔培养板(每孔2 mL)中预先用多聚赖氨酸包被的盖玻片上(用于TUNEL);以1×109/L细胞悬液种到96孔培养板(每孔0.5 mL)中(用于MTT和RTPCR检测)。培养24 h后换成维持培养液，以后每3 d半量换液1次，第5天加入阿糖胞苷，终浓度为5 mg/L(每孔25 μL)。对培养7 d的海马神经元进行尼氏染色鉴定。
　　1.4 MTT比色法检测Aβ140对神经元的毒性作用
　　培养的海马神经元中加入终浓度分别为0、0.1、1.0、10.0、20.0、30.0 μmol/L的Aβ140，37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱内孵育24 h后，向96孔板中加入5 g/L的MTT 20 μL，孵育4 h后，吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)室温振荡10 min，使结晶物充分溶解，用全自动酶标仪读取490 nm处吸光度（A）值，每组重复3孔。计算细胞存活率。细胞存活率=检测孔A值/对照孔A值×100%。
　　1.5 Aβ140作用细胞模型的建立和BFP的干预
　　参照本研究已有的实验结果，BFP的使用剂量为100 mg/L［4～6］。将培养成熟的海马神经元分为以下4组。对照组：仅加入无血清培养液；Aβ组：含Aβ140的无血清培养液；BFP组：含BFP的无血清培养液；Aβ+BFP组：含Aβ140和BFP的无血清培养液。4组海马神经元均在37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱内孵育24 h。
　　1.6 细胞凋亡的检测
　　用ROCHE公司的TUNEL原位检测试剂盒检测。细胞飞片从培养液中取出，用新鲜配制的多聚甲醛室温下固定30 min，含体积分数0.003双氧水的甲醇溶液室温封闭30 min，0.01 mol/L PBS (pH 7.4)清洗后，滴加50 μL TUNEL反应液入湿盒，37 ℃放置60 min。用含体积分数0.02的BSA封闭30 min，滴加50 μL ConverterPOD 37 ℃作用30 min。加50 μL DAB呈色3 min后，双蒸水终止呈色，自然干燥后光镜下观察。每张片随机观察5个高倍(400倍)视野并计数细胞，计算凋亡百分率，即凋亡指数(AI)，计算公式为:AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。
　　1.7 bcl2、bax和caspase3 mRNA的半定量RTPCR检测
　　1.7.1 引物设计 根据GeneBank中大鼠bcl2、bax、caspase3 mRNA以及housekeeping gene GAPDH mRNA的核酸序列，辅助DNAstar软件，分别设计引物。bcl2基因扩增产物长度217 bp，其序列为P1：5′tccattataagctgtcacag3′;P2:5′tggaccacaggtggcacagg3′。bax基因的扩增产物长度为194 bp，其序列为P3:5′gaggatgattgctgacgtg3′;P4:5′cagtgtccagcccatgatgg3′。caspase3基因扩增产物长度283 bp，其序列为P5：5′gagcagagccatgggcacgt3′;P6：5′agggccctggcacacgggac3′。GAPDH基因扩增产物长度445 bp，其序列为P7：5′accacagtccatgccatcac3′;P8：5′tccaccaccctgttgctgta3′。引物由上海生物工程技术公司合成(PAGE纯化)，合成后用去离子水稀释至终浓度10 μmol/L，分装后-20 ℃保存。
　　1.7.2 细胞总RNA的提取和RTPCR反应 收获细胞后用TRIZOL试剂提取总RNA。在第一链
　　1期钱冬萌，谢俊霞.乌鸡白凤丸对Aβ140诱导的大鼠海马神经元凋亡的保护作用3
　　cDNA的逆转录合成中使用Oligo（dT）进行逆转录，逆转录酶为AMV，反应条件为：42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min。反应完成后进行PCR扩增，在上述反应体系中加10×PCR缓冲液10 μL，25 mmol/L的MgCl2 6 μL，5 μmol/L的上下游引物各2 μL，Taq DNA酶5 U，ddh3O6 1.5 μL，使总反应体积达到100 μL。PCR反应体系如下：95 ℃变性2 min后，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环后，72 ℃延伸5 min。
　　1.7.3 PCR产物电泳和半定量分析检测 取PCR产物10 μL，在含0.5 mg/L溴化乙锭（EB）的10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果用北京亚力恩公司YLN 2000分析软件对条带行灰度扫描分析，基因表达的水平用各基因的PCR扩增条带的灰度值与GAPDH扩增条带的灰度值之比表示。
　　2 结　　果
　　2.1 Aβ140对海马神经元存活率的影响以及Aβ140使用浓度的选择
　　不同浓度的Aβ140作用于神经元24 h后，均可不同程度地引起细胞存活率的降低。与未加入Aβ的对照组神经元存活率（99.80±2.17）比较，加入0.1 μmol/L Aβ140对神经元存活率（92.70±5.43）的影响不显著（t=2.162，P&>0.05），随着Aβ140浓度的增大，细胞存活率显著降低。当Aβ140浓度到达1.0 μmol/L时，神经元存活率为84.90±6.55，与对照组比较神经元的存活率显著降低（t=3.790，P&<0.05）；浓度为10.0、20.0、30.0 μmol/L时，表现出明显的细胞毒性（t=7.516～14.639，P&<0.01）。基于上述实验结果，本研究所选用Aβ140的浓度为10.0 μmol/L，作用时间为24 h。

2.2 TUNEL法检测细胞凋亡情况
　　正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，很少能够被染色。凋亡的细胞TUNEL标记阳性，细胞核染成棕黄色。在光镜下观察空白对照组和BFP组中极少见到凋亡细胞（AI为1.21和1.38），加入10.0 μmol/L Aβ140后，Aβ组凋亡细胞明显增多（AI为18.46），而加入BFP干预后，一定程度上缓解了神经元凋亡现象（AI降至12.77）。
　　2.3 bcl2、bax、caspase3 mRNA的表达
　　内参照GAPDH在各组中扩增PCR条带亮度基本一致。各组神经元细胞中目的基因PCR扩增凝胶电泳结果见图1，经扫描测得的基因mRNA表达水平见表1。与对照组相比较，Aβ组神经元内bcl2和caspase3基因的表达水平降低（t=6.204、6.597，P&<0.01），bax基因表达水平增强(t=3.712，P&<0.05)。加入BFP干预后，对Aβ诱导的细胞内bcl2和caspase3基因的表达变化有拮抗作用，与Aβ组相比较差异有显著性(t=4.082、2.999，P&<0.05)，而对bax基因的表达没有明显的作用。与对照组比较，单纯加入BFP对细胞内的bcl2、bax和caspase3基因的表达均无显著性影响（t=0.132～0.880，P&<0.05）。表1 BFP对Aβ诱导的海马神经元细胞内bcl2、bax及caspase3 mRNA表达水平的影响
　　3 讨　　论
　　大量的体内外实验证实，高浓度的Aβ可通过诱导神经细胞凋亡而引起人、啮齿动物等多种生物的神经系统毒性［7］。本研究用MTT比色法检测Aβ140的神经毒作用，结果表明，高于10.0 μmol/L的Aβ140神经毒性显著，且该毒性作用表现出剂量依赖性。但MTT法不能确定这种毒性作用是来源于细胞的凋亡还是其他原因。细胞发生凋亡以后，细胞核DNA会出现断裂。目前DNA断裂检测是一种广为认可的检测凋亡的方法。本研究用原位检测技术，即TUNEL（TdT介导的dUTP缺口末端标记）技术，观察10.0 μmol/L Aβ140诱导海马神经元的凋亡情况，实验结果证实了该剂量的Aβ140在体外可诱导海马神经元的凋亡。这些结果与国外其他研究小组在电镜下观察到Aβ作用初期导致细胞出现凋亡的形态学特征是一致的［8］。
　　bcl2家族是细胞凋亡过程中的一类调节因子。这种蛋白家族包括促凋亡和抗凋亡两类功能相反的蛋白。bcl2家族中抗凋亡基因bcl2和促凋亡基因bax的平衡对细胞是否进入凋亡通路起着重要的作用。在培养的人原代神经细胞，Aβ140和Aβ142均可下调bcl2水平，但Aβ142降低bcl2的速度远快于Aβ140。本实验结果显示，Aβ140作用于体外培养的原代海马神经元，可下调抗凋亡基因bcl2的表达，上调促凋亡基因bax的表达，并使bcl2/bax的比值降低。细胞内bcl2/bax比值的降低可使线粒体外膜形成离子通道，促进细胞色素C释放，细胞色素C能活化caspase3引起级联反应，后者对细胞内具有功能的蛋白质进行水解、切割，引起神经细胞凋亡［7］。值得注意的是，Aβ140对bcl2基因表达的下调作用要强于对bax基因的上调。有研究者认为，神经元内bcl2表达量极少可能为其对损伤敏感的原因之一［9］。
　　雌激素对脑内神经元的保护作用已在临床上引起广泛关注。有临床研究显示，雌激素替代疗法可以降低AD的发病危险，并可以帮助维持和部分恢复女性AD病人的认知功能，延缓病程的发展［10］。但雌激素替代疗法会增加患子宫内膜癌和乳癌的危险性。BFP多用于妇科疾病的防治，效果显著。近年来的研究显示，BFP在临床用药过程中可预防AD、PD等神经退行性疾病的发生，但机制不明。本研究小组的前期研究结果也已经证实，在体外100 mg/L BFP可以抑制淀粉样蛋白对PC12细胞的毒性作用［4］，并用膜片钳技术证实，BFP可减弱因淀粉样蛋白导致细胞钙离子通道的改变［6］。
　　基于已有的研究结果，本研究仍选用100 mg/L BFP进行干预。结果表明，在培养的神经元中只加入BFP，对神经元凋亡和基因表达均无明显的作用。但在培养的神经元中同时加入Aβ和BFP，BFP可以拮抗Aβ140诱导的bcl2基因降低，提高了细胞内bcl2/bax的比值，抑制了凋亡执行蛋白之一caspase3的表达，从而改善了由Aβ诱导的神经元过度凋亡。本研究结果还提示，BFP对Aβ140作用导致的bax基因表达水平变化无明显调节作用。
　　本研究初步揭示，BFP可以缓解Aβ140诱导的海马神经元凋亡，上调细胞内bcl2/bax的比值，抑制caspase3基因的表达。因此，BFP在AD防治中具有潜在的药用价值，具有良好的应用前景。

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