关于人CD59基因突变细胞模型的建立

【摘要】 目的 建立表达人突变CD59的细胞模型，初步研究其活性。方法 以正常的CD59基因全长cDNA序列为模板，应用重叠延伸PCR法产生突变使CD59糖基化基序K41H44突变为K41K42，产生突变CD59基因，将其克隆于pALTER质粒中，构建出重组真核表达载体。应用脂质体介导法，与pcDNA3质粒共转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞， 以G418筛选阳性克隆。应用免疫化学染色及Western blot方法进一步检测突变CD59分子在转染细胞膜表面的表达。通过荧光染料释放试验，对突变CD59蛋白糖基化前后的补体限制活性进行检测。结果筛选出的阳性克隆细胞膜表面有突变CD59分子表达。将细胞的裂解物进行Western blot检测证实，在相对分子质量20 000处可见1条与CD59相当的蛋白带。表达有突变CD59分子的阳性克隆细胞染料释放率低于对照组，糖基化后染料释放率明显升高。 结论 成功地获得了表达人突变CD59分子的细胞株。
【关键词】 基因 CD59 突变 中国仓鼠卵巢细胞 补体限制作用
［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a cell model expressing human mutant CD59 molecular， and study its biological activities. MethodsNucleotides within glycosylation motif were changed to a human mutant CD59 gene (from K41H44 to K41K42) by overlap extension PCR. The mutant CD59 gene was inserted into a eukaryoticexpressing vector pALTER to form a recombinant plasmid. CHO cells were cotransfected by the recombinant plasmid and pcDNA3 via lipofectamine method. Target protein expressed on the membrane of the transfected cell lines was detected by immunocytochemistry and Western blot. Fluorescence dye was used to study the complement restriction activity of the mutant CD59 before and after glycosylation．ResultsMutant CD59 was expressed on the surface of transfected CHO cells．The dye release rate of positive clone expressing mutant CD59 molecules was lower than that of the control group. However， the rate accelerated after glycosylation. ConclusionA stable transfected cell model expressing human mutant CD59 is successfully established， which might lay the basis for further study of its biologic functions.
　　［KEY WORDS］genes， CD59; mutation; CHO; complement restriction activity
　　CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇锚于细胞膜表面的糖蛋白，相对分子质量约为20 000， 广泛分布于造血生成细胞和非造血生成细胞及多种组织细胞表面，并可以游离形式存在于尿液、唾液、泪液等多种体液中。CD59具有多种重要的免疫功能［1］，其中最主要的作用是作为补体的调节蛋白，以同源限制的方式抑制攻膜复合体(MAC)C5b9的形成，保护自身正常的组织细胞免受补体损伤。然而据报道，CD59可在糖尿病病人体内被糖基化失活，糖基化的CD59失去了 MAC限制功能 ，MAC插入内皮细胞导致了生长因子的释放，进而可引起血管增殖［2］，导致血管并发症的发生。
　　为了探讨人突变CD59的抗补体活性及其与糖尿病血管并发症之间的关系，我们构建了一种突变的CD59基因，并转入中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，以便进一步研究突变CD59的活性。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 质粒与细胞株 pALTER和pcDNA3以及克隆有CD59全长cDNA序列的pALTER质粒（pALTERCD59），均由美国哈佛大学提供。CHO细胞购自中科院上海细胞所。
　　1.1.2 主要试剂及工具酶 RPMI 1640培养液，购自HyClone公司。G418 选择抗生素，购于Amresco公司。LipofectamineTM 2000为Invitrogen公司产品。 FITC标记的CD59单抗（mAb）为Immunotech公司产品。双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧 甲酯（BCECF/AM）为SigmaAldrich公司产品。彩色蛋白质Marker由美国哈佛大学提供 。EcoR Ⅰ酶购自宝生物大连有限公司。
　　1.1.3 引物设计及合成 共设计两对引物，第一对引物用来扩增含突变位点及其上游序列的DNA片断，正向引物(FM)为：5′AAGTGTTGGAAGAAGGAGCAGTGCAATT3′（划线处为突变位点）；反向引物（R2）为：5′ATTAACCCTCACTAAAGGGA3′。第二对引物用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA片断，反向引物（RM）为：5′ATTGCACTGCTCCTTCTTCCAACACTTG3′；正向引物（F2）为：5′TAATACGACTCACTATAGGC3′。其中FM和RM 反向互补 。以上引物由上海生物工程公司合成。
　　1.2 方法
　　1.2.1 重组真核表达载体的构建 在原构建的重组质粒pALTERCD59的基础上，重新设计一对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物。通过重叠延伸PCR产生特异位点诱变［3］。将指导合成的CD59分子中的H44去掉，增加1个K42，产生突变CD59。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、纯化，并回收目的条带。将质粒pALTER及含有全长突变CD59基因的 PCR产物用EcoR Ⅰ单酶切 ，并经T4 DNA连接酶插入到pALTER质粒的EcoR Ⅰ位点，构建重组真核表达质粒（命名为mCD59pALTER）。通过转化、筛选、酶切鉴定挑选出目的片段正向连接的重组质粒，并对筛选的克隆进行序列测定、分析（由上海生物工程公司协助完成）。
　　1.2.2 细胞转染及筛选 重组质粒mCD59pALTER对CHO细胞的转染，参照Lipofectamine 2000的说明书进行。以质粒突变CD59pALTER 与pcDNA3共转染CHO细胞，同时设不带突变CD59基因的空pALTER转染CHO细胞作为阴性对照。转染后24 h， 将细胞作1∶10稀释后传代，在含800 mg/L G418的RPMI 1640中培养约2周后，出现阳性克隆。挑取单个克隆，继续抗性筛选2周，其阳性克隆的后续培养始终在G418维持剂量（400 mg/L）下进行。经连续传代10次后，收集细胞，对表达产物进行鉴定。
　　1.2.3 克隆细胞株表达产物的鉴定 采用免疫化学染色方法：收集细胞，用PBS洗3次，涂片、乙醇固定后晾干。灭活内源性过氧化物酶后，依次与羊抗人CD59 多克隆抗体、HRP兔抗山羊IgG于37 ℃作用各45 min，最后以DAB底物显色后镜下观察。 收集细胞，经裂解处理后，离心收集上清进行Western blot 分析，将不同相对分子质量蛋白质分离并进行特定条带酶免疫染色，进一步确定CD59分子的表达。
　　1.2.4 荧光染料释放试验 用BCECF/AM荧光染料渗入法，测定突变CD59蛋白糖基化前后的抗补体活性。将细胞接种于96孔板内，每孔1×104个细胞。在接种突变CD59CHO的孔中，半数孔中加入核糖（终浓度为50 mmol/L）作为实验组，另一半孔不加核糖作为对照组。培养72 h后，加入氰基硼氢化钠以稳定加合物并维持细胞体积及膜电位不变。然后置于37 ℃孵育20 min，洗涤后每孔加入BCECF/AM（终浓度为2 mg/L），再于37 ℃孵育30 min使其渗入细胞内部。然后每孔加入自制的抗CHO细胞多克隆抗体（1∶1 000稀释）50 mL，置37 ℃水浴中30 min。洗涤后，加入不同浓度（1∶1、1∶2、1∶４、1∶8）的新鲜人血清（含补体），每孔100 μL，于37 ℃作用15～20 min。吸出上清，加入到2 mL PBS液中，测定其荧光强度（FI）。最后于每孔中加入100 μL的细胞裂解液，以释放出细胞内部的BCECF/AM，并测定荧光强度（FI）。所用激发波长为500 nm，发射波长为530 nm。荧光释放率的计算公式为：染料释放率（%）=上清中染料释放的FI值/（上清中染料释放的FI值+细胞裂解后染料释放的FI值 ）×100% 。
　　2 结　　果
　　2.1 重组质粒的鉴定
　　以EcoR Ⅰ对突变CD59CHO进行酶切，可获得1条496 bp的电泳带，与所插入的片段的大小相一致（图1）。测序结果表明，突变CD59pALTER质粒含有突变的CD59全长cDNA序列。
　　2.2 转染细胞株表达产物的鉴定
　　免疫化学染色结果显示，pALTERCHO不显色；而突变CD59CHO阳性克隆的表面显棕色。Western blot 分析结果表明， 突变CD59CHO的裂解产物中，可检出相对分子质量约为20 000的突变CD59蛋白，证实突变的CD59基因在转染的CHO 细胞中获得表达。

转贴于 2.3 突变CD59的活性检测
　　BCECF/AM荧光染料释放试验表明，突变CD59具有补体限制性，糖基化后其活性下降（图2）。
3 讨　　论
　　血管内皮是一个复杂的内分泌器官，它对于动脉粥样硬化的发生起到“第一道防线”的生理防御作用。内皮细胞功能异常在糖尿病血管并发症中扮演了至关重要的角色［4］。许多资料表明，糖尿病病人血管内皮及肾脏中MAC的沉积增加［５］。MAC沉积的增加可以导致从MAC靶定的内膜释放生长因子如基底成纤维生长因子和血小板源性生长因子等［6］，而生长因子的释放可以刺激血管壁细胞增殖并可导致增殖性血管并发症的发生。人CD59作为补体调节分子，可以抑制MAC的形成，从而抑制由于MAC插入内皮细胞导致的生长因子释放而导致的血管增殖性并发症的发生。但糖尿病持续高糖血症可使CD59发生非酶糖化并损伤其功能。
　　本文采用重叠延伸PCR和基因重组技术构建了人CD59的一种突变体，使糖基化基序K41H44突变为K41K42， 44位组氨酸由一无关氨基酸取代，然后稳定转染CHO细胞，从而获得突变CD59表达细胞株。根据抗原抗体复合物可激活补体从而导致靶细胞损伤的原理，对突变CD59的补体限制活性进行了初步研究。实验结果表明，突变CD59的K41K42赖氨酸双体结构不影响突变CD59的抗补体活性，且对糖基化失活敏感，可能与糖基化位点增多有关。另外，由于细胞不能够耐受长时间的糖化，而短时间的糖化并不能够使突变CD59的抗补体活性完全丧失，因此，将来可以进一步提纯突变CD59蛋白，使其充分糖化后吸附至细胞上再做抗补体活性的检测。未来制备突变CD59单克隆抗体可以用于临床诊断，为糖尿病血管并发症诊断、预防方面提供理论依据。

参考文献

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