【摘要】 目的 观察人参皂苷Rg2对低氧心肌细胞的保护作用。方法 取新生24 h的Wistar大鼠心肌细胞，体外培养4 d，随机分为正常组、模型组、人参皂苷Rg2组。人参皂苷Rg2组加入0.025 mmol/L的人参皂苷Rg2，正常组与模型组加入等量的培养液。孵育4 h后，将模型组与人参皂苷Rg2组移入37 ℃恒温密闭容器中，连续充以体积分数0.95的N2和体积分数0.05的CO2混合气体，流速20 mL/min，持续1 h，然后应用锥虫蓝染色计数存活细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性及丙二醛（MDA）、一氧化氮(NO)的含量。结果 人参皂苷Rg2组与正常组心肌细胞凋亡率比模型组明显降低（F=4.75，q=6.44~8.09，P&<0.05）；人参皂苷Rg2组与正常组心肌细胞SOD活性、MDA和NO含量与模型组相比差异有显著性（F=5.67~13.72，q=4.35~13.68，P&<0.05）。结论 人参皂苷Rg2在体外有抗低氧损伤的作用，其作用机制可能是通过抑制细胞凋亡、提高抗氧化酶的活力、清除自由基而发挥作用。
【关键词】 人参皂苷；肌细胞， 心脏；细胞培养技术；低氧;自由基
［ABSTRACT］ Objective To investigate the protection of Rg2 on hypoxic cardiocytes. Methods Cardiocytes of 24 hour old newborn rat were cultured for four days then pided into normal group， model group and Rg2 group. Rg2 (0.025 mmol/L) was added to Rg2 group， and culture fluid was added to the normal group and model group. All were incubated for four hours， and then model group and Rg2 group were taken to 37 ℃ homeothermic hermetic container， and given 95% N2 and 5% CO2 and mixed. The morphological changes were observed. The apoptosis of cardiocytes were detected by flow cytometry (FCM). The contents of MDA and NO and the activity of SOD were determined by biochemical method. Results Compared with the model group， the apoptosis significantly decreased in the Rg2 and the normal groups (F=4.75，q=6.44-8.09，P&<0.05). Compared with the model group， the activity of SOD， the contents of MDA and NO in Rg2 group and normal group showed statistical significance (F=5.67-13.72，q=4.35-13.68，P&<0.05). Conclusion The protective effect of Rg2 on myocardial cells against anoxia in vitro possibly through inhibiting cell apoptosis， increasing the energy of antioxidase and eliminating free radicles.
［KEY WORDS］ Rg2; Myocytes， cardiac; Cell culture technique; Anoxia; Free radicle
缺血低氧是众多心脏疾病共有的病理学基础，而临床上对心脏病的治疗也是以改善心肌供血，预防及纠正心肌缺血低氧造成的损害为根本。人参是传统的名贵中药，有重要的药用价值和经济意义。目前，多种人参的复合制剂已广泛应用于治疗心脏疾病［1～3］。人参皂苷Rg2是人参三醇的组成成分，文献报道人参皂苷具有抗细胞凋亡的作用［4，5］。本实验通过体外培养成熟心肌细胞，建立急性气体低氧模型，锥虫蓝染色细胞计数，并做流式细胞仪检测以及酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MAD)、一氧化氮(NO)的含量，以此来探讨人参皂苷Rg2体外是否有抗低氧损伤的作用及其作用机制，为临床用药提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物
新生24 h的Wistar大鼠10只，清洁级，由青岛市药检所动物实验中心提供。
1.2 主要试剂
水溶性人参皂苷Rg2 (吉林省中医中药研究院提供)，DMEM、小牛血清(杭州四季青生物材料工程公司)，SOD、MAD、NO试剂盒(南京建成生物工程研究所)，多聚赖氨酸(Sigma公司)。
1.3 主要仪器设备
OLYMPUS，BX 50，PM-20 系统显微镜(日本)，PM-6，OLYMPUS解剖显微镜(日本)，二氧化碳细胞培养箱(上海福玛实验设备有限公司)，YJ超净工作台（垂直单向流型，苏州市洁净技术研究所）。
1.4 方法
1.4.1 心肌细胞培养及鉴定 24 h大鼠乳鼠，以体积分数0.75的乙醇浸泡消毒，开胸取出心脏，放入PBS中冲洗，尽量去除血迹。将心尖部肌肉剪成2 mm×2 mm×2 mm左右碎块，加入胶原酶、胰蛋白酶消化，反复吹打，悬液沉淀后，吸取上清液(弃第一次收集液)，直至将组织块完全消化为止，然后将所收集的细胞悬液1 500 r/min离心15 min，沉淀PBS洗2次。加入培养液(体积分数0.10 的FBS，体积分数0.10 HS，M199与DMEM 比例为1∶4，0.1 mmol/L MBrdU)，将细胞浓度调整为l×109 /L，然后以每孔2 mL接种于6孔培养板中。4 d后光镜观察。
1.4.2 分组及处理 原代心肌细胞培养4 d后，随机分为3组：正常组、模型组及人参皂苷Rg2组，每组4个六孔板。人参皂苷Rg2组加入0.025 mmol/L人参皂苷Rg2进行孵育，正常组及模型组加入等量的培养液。
1.4.3 低氧模型的制备 按文献［6］的方法。将已分组给药的细胞继续培养4 h，将模型组和人参皂苷Rg2组移入37 ℃恒温密闭容器中，连续充以体积分数0.95的N2和体积分数0.05的CO2混合气体，流速为20 mL/min，持续1 h。
1.4.4 心肌细胞凋亡率的检测 将上述处理过的细胞制成单细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，去上清，PBS冲洗，体积分数0.75的乙醇固定，400目筛网过滤，加PI染液，应用流式细胞仪（激发波长488 nm，发射波长530 nm）检测心肌细胞凋亡率。
1.4.5 心肌细胞上清液中SOD活性及MDA、NO含量的测定 按试剂盒说明书的要求先求出样本的最佳加样量。心肌细胞经上述同样处理后，取细胞上清液，按试剂盒说明书的要求测定各样本的吸光度，并依下列公式计算出SOD活力及MDA、NO的含量。计算公式分别为：SOD活力(kU/L)=(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度÷50%×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数；MDA含量(mmol/L)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10 mmol/L)×样本测试前稀释倍数；NO含量(μmol/L)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度(100 μmol/L)×样品测试前稀释倍数。
2 结 果2.1 细胞鉴定
光镜观察可见细胞自主搏动，细胞呈梭形树枝状分支，并隐约可见心肌横纹，为心肌细胞。
2.2 SOD活性、MDA及NO含量的测定
人参皂苷Rg2组、正常组SOD活性、MDA及NO的含量与模型组比较差异有显著性(F=5.67~13.72， q=4.35~13.68，P&<0.05)；人参皂苷Rg2组与正常组各指标比较差异无显著性（P&>0.05）。见表1。 表1 各组心肌细胞SOD活性及MDA、NO含量
2.4 心肌细胞凋亡率的检测
正常组、模型组及人参皂苷Rg2组的心肌细胞凋亡率分别为(1.24±1.01)%、(6.52±1.24)%和(2.38±0.97)%。人参皂苷Rg2组及正常组与模型组比较，差异有显著性（F=4.75，q=6.44、8.09，P&<0.05）；人参皂苷Rg2组与正常组相比，差异无统计学意义(P&>0.05)。
3 讨 论
人参皂苷Rg2是人参三醇的组成成分，为人参的重要提取物。随着人们对中医中药的日渐重视，人参皂苷也成为近年来学者们研究的重点［7~9］。已有的文献证明人参皂苷确实对某些组织细胞可以起到抗氧化、抗衰老抗损伤的作用。众所周知，心脏是对缺血低氧最为敏感的器官之一。因此，研究人参皂苷对心肌细胞的保护性作用更具有临床意义。本研究采用新生24 h的Wistar大鼠成熟心肌细胞培养模型，该模型可直接研究药物对心肌细胞低氧损伤的机制。缺血低氧是临床上众多心脏疾病共有的病理学基础，心肌细胞凋亡是心肌缺血早期心肌细胞死亡的主要因素，而缺血再灌注损伤则加速加重其凋亡［10］。 本实验采用PI单染法，通过流式细胞仪检测显示，模型组细胞凋亡率较其余两组升高。说明低氧能够引起细胞凋亡，而人参皂苷Rg2能够抑制这种低氧所引起的凋亡。
正常情况下体内产生少量自由基属生理范围，可被抗氧化防御系统清除，使自由基的产生及清除处于动态平衡状态。当急性低氧时，此平衡状态被打破，自由基积蓄从而造成心肌细胞的损伤。其中MDA含量的高低就可以反映机体内脂质过氧化程度和细胞损伤程度。本实验中，模型组MDA含量比正常组明显升高，说明低氧损伤了细胞，这与文献报道结果一致［11］，而人参皂苷Rg2组比模型组明显降低，表明人参皂苷Rg2有抗低氧损伤的作用。机体防御系统中主要有SOD，其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，常与MDA相配对作为检测机体氧化程度的指标。本实验中，模型组中SOD活性比正常组明显降低，人参皂苷Rg2组则比模型组明显升高，说明低氧抑制了SOD的活性，而人参皂苷Rg2可通过抑制脂质过氧化发挥抗低氧损伤的作用，这与MDA的结果相一致。
综上所述，人参皂苷Rg2有抗低氧损伤的作用，可能与抑制细胞凋亡、提高抗氧化酶的活性、清除自由基有关。
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