【摘要】 目的 探讨1-磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号传导通路效应物在胎鼠肺发育过程中的表达。方法 运用Western蛋白印迹方法检测不同胎儿期鼠肺上皮细胞中AKT、磷酸化AKT (pAKT)及相关蛋白的表达。运用免疫组织化学方法检测不同胎儿期鼠肺上皮细胞中pAKT的表达水平。结果Western蛋白印迹法显示，AKT在不同胎儿期肺上皮细胞中的蛋白表达无明显差异；第12天胎鼠肺pAKT高度表达，第14天开始减少；第12天胎鼠肺cyclinD1高度表达，第14天开始减少；第12天胎鼠肺SPC低度表达，第14天开始逐渐增加。免疫组织化学法显示，第14天胎鼠肺上皮细胞中pAKT高度表达，第18天胎鼠肺上皮细胞中pAKT无明显表达。结论 PI3K-AKT信号传导通路通过许多生物过程在胎鼠肺发育中起重要作用。
【关键词】 丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B 肺发育 小鼠 近交ICR
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of PI3K-AKT signal pathway in fetal mouse lung development. MethodsThe expression of AKT， phosphorylated AKT (pAKT) and the downstream proteins were examined with Western blotting and immunohistochemistry in the epithelium of fetal mouse lung at different time points.ResultsWestern blotting showed that the expression of AKT was not significantly changed in embryonic lungs during development， while phosphorylated AKT (pAKT) was highly expressed on embryonic day 12 (E12) and started decreasing from embryonic day 14 (E14). CyclinD1 was highly expressed on E12 and started decreasing from E14. SPC was lowly expressed on E12 and started increasing from E14. Immunohistochemical study showed that pAKT was expressed in the respiratory epithelium on E14. However， pAKT was not obvious expressed on E18. ConclusionThe PI3K-AKT signal pathway plays a pivotal role in mouse lung development through various biological processes.
［KEY WORDS］Serine/threonine protein kinase B; Lung development; Mice， inbred ICR
丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B（又被称作AKT）参与多种细胞功能，例如细胞再生、分化和存活等［1］。1-磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）可以调节AKT活性。AKT被活化后，与细胞膜分离后进入细胞核，并且在细胞核中被磷酸化后可以调节许多生物过程。据文献报道，成纤维细胞生长因子(FGFs)可以通过激活PI3K-AKT信号传导通路在许多分支器官的发育中起重要作用，例如它能促进肾脏、乳腺、前列腺等器官的发育［2］。然而，PI3K-AKT信号传导通路和肺发育的关系至今仍未清楚。据文献报道，PI3K-AKT的下流效应物，如Rac1和Cdc42能刺激cyclinD1的表达［3］。cyclinD1是哺乳动物细胞循环链的关键调节器， 它可以增强呼吸道上皮细胞的增生。在肺的发育过程中，决定细胞类型分化的转录因子中表面活性脱辅基蛋白C(SPC)转录因子可以加强呼吸道上皮细胞的分化［4］。然而，cyclinD1 和SPC是如何通过PI3K-AKT信号传导通路来调节肺发育的仍不清楚。因此，本实验探讨PI3K-AKT信号传导通路效应物在肺发育中所起的作用。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物
ICR大鼠由日本SLC公司提供。为了得到胚胎鼠的肺，让大鼠在夜间交配，次日作为胚胎第0天（E0），胚胎鼠第12、14、16、18天（E12、E14、E16、E18）的肺被用于本实验中作蛋白印迹检测。E14和E18的胚胎鼠肺用于免疫组织化学染色。
1.2 Western印迹检测
大鼠在受孕E12、E14、E16、E18时分别被处死，解剖留取胚胎鼠的肺组织，按每50 mg肺组织加500 μL细胞裂解液（包括NP-40、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、苯甲磺酰氟）将肺组织制成匀浆。用牛血清清蛋白绘制标准蛋白曲线，检测样品蛋白浓度。取含总蛋白25 μg的组织裂解产物，于120 g/L的SDS-PAGE上电泳（BioRad公司，美国），转PVDF膜，封闭后以1∶1 000兔抗鼠单克隆抗体AKT(Santa Cruz公司，美国)，pAKT(Santa Cruz公司，美国)， cyclinD1 (Santa Cruz公司，美国)，SPC(Santa Cruz公司，美国)，β-actin(Sigma 公司，日本)室温孵育2 h。加入1∶5 000羊抗兔IgG辣根过氧化物酶抗体(Santa Cruz公司，美国) 室温孵育1 h。抗原抗体反应后，用ECL蛋白印迹检测系统（Amersham公司，美国）进行检测，再经X线片曝光。曝光胶片用Image Scanner(Amersham公司)扫描，ImageQuant TLV 2003软件分析各条带灰度值，结果以AKT与β-actin蛋白条带灰度值的相对比值表示。AKT、pAKT、cyclinD1、SPC、β-actin组按相同实验条件重复3次，进行统计分析。
1.3 免疫组织化学检测
在室温下，E14和E18的胚胎鼠肺放入40 g/L的多聚甲醛磷酸缓冲溶液（pH 7.3）中固定3 h，将固定组织在磷酸缓冲液中冲洗后，用OCT混合物包埋后用液氮冷冻。取每组中的每一个OCT混合物包埋肺组织块，连续切成5 μm厚的组织片置于玻片上，经蒸馏水冲洗后，按常规ABC免疫组织化学法染色。pAKT（Cell Signaling公司，美国）滴度均为1∶400，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染。胞核中见棕黄色颗粒为阳性。
1.4 统计学处理
计量资料以x±s表示，用SPSS 13.0软件进行统计分析。
2 结 果
2.1 Western印迹检测
AKT在胎儿肺组织发育过程中表达强而且无改变，各时间点比较差异均无显著意义（P&>0.05）。pAKT在E12肺组织中表达最强，然后随着胎龄的增加，其表达逐渐减弱（F=58.886，q=2.384~17.289，P&<0.05）。cyclinD1从E12至 E18表达逐渐减弱（F=18.693，q=2.544~10.194，P&<0.05）。而SPC从E12至E18表达逐渐增强（F=130.290，q=7.673~26.444，P&<0.05）。见图1、表1。
pAKT在E14肺组织的呼吸道上皮细胞中表达最强，而在E18肺组织的呼吸道上皮细胞中无明显表达。
图1 AKT/pAKT、cyclinD1和SPC在鼠E12、 E14、E16、E18肺组织蛋白质的表达表1 AKT、pAKT、cyclinD1、SPC在鼠肺组织中表达含量变化
3 讨 论
本实验研究了鼠胎儿肺发育过程中AKT以及其磷酸化形式的蛋白质表达，并且与细胞增生及分化调节因子即细胞增生活化因子cyclinD1和细胞分化标志物SPC进行了比较。本实验结果显示，磷酸化AKT在胎儿肺发育的早期表达较强，而到出生前表达逐渐减弱。这种逐渐减弱的蛋白质表达方式与胎儿肺组织细胞增生活力的改变是一致的。因为在本实验中细胞增生活化因子cyclinD1在胎儿肺发育早期表达强，说明其细胞增生活力高，而随着胎龄的增加，其表达逐渐减弱。另外，本实验通过免疫组织化学法检测出在胎儿肺发育的早期，磷酸化AKT大量存在于肺呼吸道上皮细胞中，而在肺发育的晚期呼吸道上皮细胞中无明显表达，从而推测出磷酸化AKT与早期肺发育有关，并且磷酸化AKT通过激活细胞循环链的调节器cyclinD1而使细胞增生活力增强，促进呼吸道的构建。
据报道，在鼠肺发育的E12～E14，SPC可以在原始未分化的肺上皮细胞中表达，而在鼠肺发育的E17.4至生后第5天，肺泡Ⅰ型及Ⅱ型上皮细胞开始分化，此时SPC仅在Ⅱ型上皮细胞中表达［5］。这与随着肺发育，肺的细胞分化及增生增强，肺功能逐渐完善的理论相一致［6］。但是，我们不能从简单的SPC表达上说明肺泡细胞是如何分化的。肺泡细胞分化标志物SPC随着胎龄的增加表达增强，而磷酸化AKT表达减弱，考虑在PI3K-AKT信号传导通路下游存在一个负反馈信号。据报道，AKT可以通过抑制GSK-3活力来调节许多生物过程［7］。此理论支持本实验结果。
根据本实验结果，我们不能简单地阐明PI3K-AKT信号传导通路在肺组织发育过程中的重要意义，然而可以提示磷酸化AKT在肺组织发育中可以调节细胞增生调节因子cyclinD1和分化调节因子SPC的活力，从而推测出这些因子变化可能与胎儿肺组织发育中的生物现象有关。总之，我们认为PI3K-AKT信号传导通路作用在胎儿肺发育中的许多重要生物过程中，如果我们能明确细胞增生及分化的机制，对肺发育异常、肺组织重塑和肺癌的治疗及预防将有重要意义。
【
参考文献
】［1］ RAMEH L E， CANTLEY L C. The role of phosphoinositide 3-kinase lipid products in cell function［J］. J Biol Chem， 1999，274:8347-8350.
［2］ DAVIES J A. Do different branching epithelia use a conserved developmental mechanism［J］. Bio Essays， 2002，24，937-948.
［3］ AMMII A J， PANETTIERI R. Signal transduction in smooth muscle invited review: the circle of life: cell cycle regulation in airway smooth muscle［J］. J Appl Physiol， 2001，91:1431-1437.
［4］ TICHELAAR J W， LU W， WHITSETT J A. Conditional expression of fibroblast growth factor-7 in the developing and mature lung［J］. J Biol Chem， 2000，275:11858-11864.
［5］ WUENSCHELL C W， SUNDAY M E， SINGH G， et al. Embryonic mouse lung progenitor cells coexpress immunohistochemical markers of perse mature cell lineages［J］. J Histochem Cytochem， 1996， 44:113-123.
［6］ DAVID W， MARGARET S， DENISE T， et al. The molecular basis of lung morphogenesis［J］. Mechanisms of Development， 2000，92:55-81.
［7］ DEPREZ J D， VERTOMMEN D R. Phosphorylation and activation of heart phosphofructo-kinase by protein kinase B and other protein kinase of the insulin signaling cascades［J］. J Biol Chem， 2000，272:17269-17275.