关于大鼠延髓背角和脊髓背角内PKCγ阳性神经元向中缝隐核的投射

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【摘要】 目的 研究大鼠延髓背角和脊髓背角浅层内蛋白激酶C γ亚单位(PKCγ)阳性神经元向中缝隐核(NRO)的投射。方法 应用荧光金(FG)逆行追踪和PKCγ免疫荧光组织化学染色相结合的双标记方法，观察大鼠延髓背角和脊髓背角内PKCγ阳性神经元向中缝隐核的投射。结果 将FG注入NRO，在延髓背角和脊髓背角的Ⅰ～Ⅲ层内可见FG逆标神经元；PKCγ阳性神经元主要分布于延髓背角和脊髓背角的Ⅱ层内侧部及Ⅱ、Ⅲ层交界处，Ⅰ、Ⅲ层内较少；延髓背角Ⅰ层和脊髓背角Ⅰ～Ⅲ层可观察到FG逆标并呈PKCγ阳性的双标神经元。结论 延髓背角和脊髓背角浅层向NRO 投射的神经元为PKCγ阳性神经元，其在向NRO 传递信息的通路中可能发挥重要作用。
【关键词】 蛋白激酶C 中缝隐核 延髓背角 脊髓背角 荧光免疫测定 大鼠
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the projections of protein kinase C γ isoform (PKCγ) immunoreactive neurons from the medullary and spinal dorsal horns to the nucleus raphe obscurus (NRO) in rat．MethodsThe double labeling method of fluorogold (FG) retrograde tracing combined with immunofluorescence histochemical staining was used．ResultsAfter injecting FG into the NRO， FG retrogradely labeled neurons were found in laminae Ⅰ—Ⅲ of the medullary and spinal dorsal horns. PKCγ immunoreactive neurons were mainly observed in the inner part of laminaⅡand the border region between laminaeⅡand Ⅲ，while in laminae Ⅰ and Ⅲ，only a few PKCγ immunoreactive neurons were observed．Some FG1abeled neurons in lamina Ⅰ of the medullary and laminae Ⅰ—Ⅲ of the spinal dorsal horn also exhibited PKCγ immunoreactivity．ConclusionThe present results indicate that PKCγ containing neurons in the medullary and spinal dorsal horns project to the NRO，suggesting that PKCγ might be involved in the transmission of nociceptive information from the medullary and spinal dorsal horns to the NRO.
　　［KEY WORDS］protein kinase C; raphe nuclei; medullary dorsal horn; spinal dorsal horn; fluoroimmunoassay; rats
　　延髓背角和脊髓背角浅层(Ⅰ、Ⅱ层)是外周疼痛信息向中枢传递的门户，在疼痛信息的传递和调控过程中发挥着重要作用。中缝隐核接受延髓背角和脊髓背角上行投射神经元的传入信息，经整合后再启动下行抑制系统，对延髓背角和脊髓背角神经元发挥选择性抑制作用［1］。蛋白激酶C(PKC)是重要的细胞内信号转导分子，在脊髓背角浅层主要定位于兴奋性神经元［2］，并参与外周伤害性信息的传递［3，4］。PKC的γ亚单位（PKCγ）是否只是存在于延髓背角和脊髓背角浅层向中缝隐核（NRO）的投射神经元中，至今缺乏形态学依据。本研究应用荧光金(FG)逆行追踪和PKCγ免疫荧光组织化学相结合的双标记方法，观察延髓背角和脊髓背角浅层内PKCγ阳性神经元向NRO 的投射。
　　1 材料与方法
　　1．1 实验动物
　　成年SD大鼠12只（180～230 g），雌雄不拘。
　　1．2 实验方法
　　1．2．1 逆行追踪 动物在戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉下，根据PAXINOS和WATSON脑定位图谱，用前端接有微玻管（尖端外径60 μm）的微量注射器将0.15 μL双蒸水配制的40 g/L FG经压力缓慢注入NRO，注射时间15～20 min，注毕留针10 min。注射点的坐标为耳间线后3.72 mm，中线深度10.60 mm。
　　1．2．2 标本制备 动物存活6～7 d后，在戊巴比妥钠腹腔注射（100 mg/kg）深麻醉下，经左心室插管至升主动脉，先用100 mL生理盐水快速冲洗血液，再用500 mL含40 g/L多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB 0.1 mol/L，pH 7.4）灌注固定30 min以上。灌注完毕立即取出脑干和脊髓，移入含300 g/L蔗糖的PB内直至组织块沉底（4 ℃）。将注射部位、脑干尾段和脊髓颈段做冷冻连续冠状切片，切片厚30 μm，脑干尾段和脊髓颈段的切片隔3张取1张，分为4套收集于磷酸盐缓冲液（PBS 0.01 mol/L，pH 7.4）内。将第1、2套切片分别裱于经明胶处理的载玻片上，用于FG注射区的范围和FG标记神经元分布的观察以及NISSL染色。
　　1．2．3 免疫组织化学染色 将第3套切片经PBS充分漂洗后，行PKCγ的免疫荧光组织化学染色，具体步骤如下：①兔抗PKCγ血清（1∶1 000，Santa Cruz）中孵育48 h（4 ℃）；②Biotin标记的羊抗兔IgG血清（1∶200，Vector）室温孵育4 h；③Avidin结合的TexasRed （1∶1 000，Vector）室温孵育2 h。各抗体或复合物的孵育液均用含体积分数为0.003 Triton X100的PBS稀释。以正常兔血清代替兔抗PKCγ血清并孵育第4套切片，作阴性对照。上述各步骤间，均用PBS洗片3次，每次10 min。裱片，干燥，甘油和PBS （1∶1）混合液封片。
　　1．2．4 结果观察 在荧光显微镜（Olympus，BX60）下分别用WU 和WG镜组观察FG标记神经元和PKCγ阳性神经元。观察FG标记神经元的激发光波长和发射光波长分别为350～395 nm和530～600 nm；观察PKCγ阳性神经元的激发光波长和发射光波长分别为590 nm和615 nm。
　　2 结　　果
　　2．1 FG逆标神经元的分布
　　FG逆标神经元主要见于延髓背角的Ⅰ层和Ⅲ层以及脊髓背角的Ⅰ～ Ⅲ层。FG逆标的神经元胞体多在9～35 μm之间并呈圆形、卵圆形，大型（≥35 μm）神经元较少见。
　　2．2 PKCγ阳性神经元的分布
　　PKCγ阳性神经元主要见于延髓背角和脊髓背角的Ⅱ层内侧部及Ⅱ、Ⅲ层的交界处，PKCγ阳性神经元及其突起在这些部位呈丛状密集分布；Ⅰ层、Ⅱ层外侧部和Ⅲ层深部仅有少量PKCγ阳性神经元；PKCγ阳性神经元的形态和FG逆标神经元的形态相似。
　　2．3 FG/PKCγ双标神经元的分布
　　延髓背角和脊髓背角浅层的部分FG逆标神经元呈PKCγ免疫荧光组化染色阳性。这些FG/PKCγ双标神经元主要见于延髓背角的Ⅰ层和脊髓背角的Ⅰ～Ⅲ层。FG/PKCγ双标神经元分别占延髓背角Ⅰ层内FG标记神经元或PKCγ阳性神经元总数的62.1%（125／201）或29.0%（138／476），脊髓背角Ⅰ层内FG标记神经元或PKCγ阳性神经元占总数的30.9%（207／669）或21.3%（207／968），脊髓背角Ⅱ、Ⅲ层内双标神经元较少见，仅占此二层内FG逆标神经元或PKCγ阳性神经元总数的22.2% （46／207）或0.8%（26／3244）。
　　3 讨　　论
　　延髓背角和脊髓背角浅层（Ⅰ、Ⅱ层）主要接受外周传递伤害性信息的初级传入Aδ纤维和C纤维，是外周伤害性信息传递及调控的关键结构，在伤害性信息的传递、整合和调控过程中发挥重要作用。NRO是中枢神经内源性镇痛系统的重要组成部分，NRO内的神经元除了接受中脑中央灰质等上位脑结构支配外，还接受延髓背角和脊髓背角等部位上行投射纤维的侧支传递的伤害性信息，经整合后再启动下行抑制系统，参与对延髓背角和脊髓背角浅层神经元活动的调控效应［1］。

PKCγ在脊髓背角疼痛信号处理过程中的作用已有诸多报道，它在组织损伤性（炎性）疼痛和神经损伤性疼痛中都扮演着重要的角色。在皮下注射甲醛模型动物， PKCγ拮抗剂neomycin可抑制大鼠的自发痛，而激动剂佛波酯的作用则相反［5］。PKCγ基因敲除小鼠的发育正常，但坐骨神经结扎后动物的痛反应减弱［3］。正常时主要存在于细胞膜上的PKCγ在外周炎性刺激下表达上调并从胞浆向胞膜迁移［4］。我们在坐骨神经切断的模型中也观察到PKCγ阳性神经元在脊髓腰段背角浅层明显增加。
　　以往研究显示，延髓和脊髓背角Ⅰ层内90%以上向丘脑或臂旁核投射的神经元呈PKCγ阳性［6］，本研究仅见到30％～72％的延髓背角和脊髓背角Ⅰ层向NRO投射的神经元呈PKCγ阳性，说明在大鼠延髓背角和脊髓背角Ⅰ层向NRO投射的神经元呈PKCγ阳性者较少。脊髓背角Ⅱ层也见到有FG/PKCγ双标神经元，此点与以往的研究结果有所不同［6～8］。脊髓背角Ⅱ层主要由中间神经元和少量投射神经元构成［9］，是传递外周伤害性信息的初级传入纤维的主要终止部位，在伤害性信息的传递过程中发挥重要作用［1］。脊髓背角Ⅱ层PKCγ阳性神经元向NRO投射，这些投射神经元的形态与我们以往观察到的形态非常相似［9］，提示这些投射神经元主要传递疼痛信息。POLGAR等[2]的研究证实，PKCγ阳性神经元几乎不含抑制性递质及受体，但却与P物质（SP）等兴奋性递质的受体共存，本文也观察到脊髓背角Ⅱ层内含SP的神经元终末和C纤维的神经元终末与PKCγ阳性神经元形成突触联系［10］。这些结果均支持PKCγ阳性神经元参与了伤害性信息向脊髓以上中枢（包括NRO）的传递，说明它们在伤害性信息的传递过程中所起作用可能是至关重要的。

参考文献

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