逐痰通络汤对急性期脑出血大鼠血IL1β、IL6表达的影响

【摘要】 探讨中药逐痰通络汤对脑出血损伤的保护作用。［方法］将大鼠随机分为正常对照组（N组）、假手术组(K组)、模型组(C组)和给药组(Z组)，采用胶原酶诱导法建立大鼠脑出血模型，观察各组动物神经功能缺损并评分，ELISA法检测血清IL1β、IL6的表达。［结果］①通过神经功能评分，Z组与C组比较，第1、2d无明显统计学差异，第3d有差异(P<0.05)，评分较低，第7d有显著差异(P<0.01)；②与K组比较，C组IL1β、IL6含量在第1d时开始升高(P<0.05)，第2、3d到达高值(P<0.001)，第7d接近正常范围；③给药后，第2d，Z组IL1β、IL6含量较C组明显下降(P<0.05)，第3d，显著下降(P<0.001)。［结论］逐痰通络汤能抑制IL1β、IL6的表达和释放，从而减轻炎症反应，对脑出血后的继发性神经元损伤起保护作用。

【关键词】 逐痰通络汤；脑出血（ICH）；白细胞介素1β；白细胞介素6

　　 ChinaAbstract:［Objective］ To investigate the effect of Zhutan Tongluo Tang on the expression of interleukin1β(IL1β) and interleukin6(IL6) and changes of nerve function in acute cerebral hemorrhage rat. ［Methods］ Rats were randomly pided into four groups: normal control group（N）， shamoperative group(K)， model group(C) and Zhutan Tongluo Tang group(Z)， Collagenase was used to establish rat model of intracerebral hemorrhage， each group of animal nerve function damage was evaluated and graded after operation， ELISA method was used to test the expression of IL1β and IL6 in blood.［Results］ 1.Score of nerve function: there was no significant difference between Z and C group in the first 1，2d. There was difference on 3d(P<0.05)， and significant difference on 7d (P<0.01). For Z group had lower score with C group; 2. The level of IL1β and IL6 began to increase in C group on 1d， compared with K group( P< 0.05)， and reach high level in the first 2，3d( P< 0.001)， the level came to normal range on 7d; 3. After administration， compared with C group， the level of IL1β and IL6 began to decrease on 2d( P< 0.05)， and decreased significantly on 3d( P< 0.001).［Conclusion］ Zhutan Tongluo Tang can depress the expression and release of IL1β and IL6， inhibiting inflammation response， which has an evident protective effect on secondary injured neuron after intracerebral hemorrhage in rats.

　　Key words：Zhutan Tongluo Tang; intracerebral hemorrhage; IL1β; IL6

　　急性期脑出血（ICH）是临床上多发病、常见病。逐痰通络汤是刘时觉教授经验方，针对中风病急性期痰瘀互结、气血瘀阻的病机，辨证施治，具有较好的临床疗效。本实验观察逐痰通络汤对急性期ICH大鼠血IL1β、IL6表达的影响，探讨其可能机制。

　　1 实验材料

　　1.1 实验动物及分组

　　清洁级雄性SD大鼠，体重（250±20）g，温州医学院实验动物中心提供。根据随机原则，将116只大鼠分为4组：正常对照组（N）、假手术组（K）、模型组（C）、给药组（Z）。对照组6只，后3组设术后6h、24h、48h、72h、7d共5个时间点，各时间点8只大鼠（K组各时间点6只）。

　　1.2 药物及其制备

　　逐痰通络汤：大黄10g、胆南星10g、地龙10g、全蝎6g、天麻10g、郁金10g、石菖蒲6g、天竹黄10g，于常压100℃煎煮30min去渣，8层纱布过滤，浓缩成生药1.25g/ml，4℃保存备用。

　　1.3 主要试剂及仪器

　　大鼠脑立体定向仪，Ⅶ型胶原酶由美国Sigma公司提供，IL1β、IL6检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。电子天平，离心沉淀机，550型酶标仪，摇床，烤箱等。

　　2 实验方法

　　2.1 ICH模型的建立

　　（胶原酶诱导法）将大鼠麻醉后俯卧位固定于立体定位仪上，于前囟前0.2mm，中线旁开3mm钻一直径1mm的孔，以微量进样器沿钻孔进针深6mm(尾状核)，然后缓慢注入含0.5U Ⅶ型胶原酶的生理盐水2μl，时间2min，留针5min，退针0.5mm，再留针5min，缓慢拔出针头，骨蜡封窗，缝合皮肤。

　　2.2 给药方法

　　给药组于造模后6h、24h、48h、72h、7d，5个时间点给予逐痰通络汤灌胃，（大鼠灌胃量按10ml/（kg·d），假手术组、模型组给予等量生理盐水，正常组按常规饲养。

　　2.3 神经功能评分

　　大鼠造模后6h及第1d、2d、3d、7d观察神经功能障碍并评分，评分标准采用Bederson［1］6级5分法:正常为5级(0分)；对侧上肢不能完全伸展为4级(1分)；向对侧推时抵抗力下降(置于光滑塑料板上)为3级(2分)；提尾时向对侧转圈为2级(3分)；自动转圈为1级(4分)；无自发性活动、意识障碍为0级(5分)。假手术组不予评分。

　　2.4 标本的收取及处理

　　各组大鼠在上述时间点神经功能评分后2h（即给药组灌胃后2h），用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，直视下行右心室穿刺抽血，分别用EDTA抗凝管及促凝管装取动脉血，制备血清。血清制备：将促凝血静置0.5h后，以3000r/min离心10min，取上清液，置于-80℃冰箱保存。

　　2.5 IL1β、IL6的测定

　　采用双抗体酶联免疫吸附法（ELISA），具体步骤严格按照试剂盒说明书进行，最后用全自动酶标仪在450nm处读取吸光度值(OD值)，根据样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。

　　2.6 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，数据以均数±标准误(s)表示，药物作用以Oneway ANOVA方法分析。

　　3 实验结果

　　3.1 神经功能评分

　　除假手术组外，模型组和给药组大鼠在麻醉清醒之后均出现一定程度的神经功能缺损症状。见表1。表1 大鼠急性脑出血后神经功能缺损评分(略)。与对照组比较，*P<0.05，▲P<0.01另外该评分是判断造模成功的标准，5级和0级造模大鼠在测定IL1β、IL6时需排除。

　　3.2 IL1β测定结果

　　见表2。表2 IL1β在脑出血后各时间点表达的动态变化（略)。模型组与假手术组比较：#P<0.01，##P<0.005，###P<0.00；药物组与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01模型组内与6h时间点比较：▲P<0.001

　　3.3 IL6测定结果

　　见表3。表3 IL6在脑出血后各时间点表达的动态变化（略)
　
　　模型组与假手术组比较，#P<0.05，##P<0.001；药物组与模型组比较：*P<0.005，**P<0.001；模型组内与6h时间点比较：▲P<0.05，▲▲P<0.001

　　4 讨论

　　ICH又称出血性中风，属中医学“中风”范畴，其病理以风、火、痰、瘀、虚为特征，急性期则以风、火、痰、瘀为主。中风病的发生发展，是多种致病因素相互作用的结果。血瘀证是中风病的基本证候之一，可贯穿整个病程，但中风本身也会产生痰、瘀等损伤脑络，影响气血正常运行；痰浊是中风病急性期主要病因病机之一，发病3天后其作用更加突出，可以成为主证候［2］，痰气郁结，经隧不利，气机逆乱，则痰瘀互结。因此，除痰化浊与活血化瘀同等重要。痰通络汤中重用大黄活血通腑为君；郁金活血行气，胆南星祛风化痰为臣；佐以天竹黄清热化痰，石菖蒲化痰开窍；天麻、地龙、全蝎熄风通络。全方共奏逐痰祛瘀，熄风通络之功。

　　IL1β是促炎性细胞因子，它是一类具有广泛作用的多肽。IL1β是脑组织中的主要形式，在免疫和炎症反应中起多种生物活性的细胞因子［3］。研究表明中枢神经系统的小胶质细胞、星形胶质细胞可直接合成IL1β。IL1β能刺激粘附分子的产生，增加内皮细胞的粘附，并通过刺激内皮细胞表达白细胞粘附分子，使白细胞聚集在出血周围，加重脑组织的损害；能促使内皮细胞激活血液中的凝血酶原进入炎症前状态，增强白细胞反应，加重脑损伤，诱发神经细胞凋亡［45］。

　　IL6主要由单核细胞和巨噬细胞产生，是重要的致炎因子，具有多种生物学效应，不但参与免疫反应、血细胞生成和应激反应，既有促炎作用又有抗炎作用，对中枢神经系统发挥神经营养、神经保护和神经毒性多重作用。高浓度的IL6能增加内皮细胞表达细胞间黏附分子，使白细胞与内皮细胞的粘附性增强，结果阻塞微血管。另外，还能激活补体系统，产生细胞损害［6］。

　　本实验发现C组和K组比较，IL1β、IL6含量在第1d时开始升高，第2、3d到达很高值，第7d接近正常范围；给药后，第2d，Z组IL1β、IL6含量较C组明显下降(P<0.05)，第3d，显著下降；神经功能评分中，第1、2d无明显统计学差异，第3d有差异，第7d有显著差异。分析以上结果：①第3d行为学评分和药物组治疗结果吻合；②第1、2d，IL1β、IL6含量下降明显，行为学结果不显著，分析其原因可能与神经保护作用的滞后性有关；③第7dIL1β、IL6结果暂无法判断药物是否起作用。由此研究提示，应用中药治疗后，IL1β、IL6的表达在第1、3d明显减少，表明逐痰通络汤可能通过抑制炎症反应，抑制IL1β、IL6的表达，起到神经保护作用。

参考文献

1］Berderson JB， Pitts LH， TsujM， et al.Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke， 1986， 17 (3): 472476.

　　［2］王顺道，杜孟华，解庆华，等.中风病急性期证候演变规律的研究［J］.中国中医急症，1996，5(3):121124.

　　［3］Boutin H，LeFeuvre RA， Horai R.Role of IL1alpha and IL1beta in ischemic brain damage ［J］.J Neurosci，2001， 21 (15): 55285534.

　　［4］Holmin S，Mathiesen T.Intracerebral administration of interleukin1 beta and induction of inflammation， apoptosis， and vasogenic edema［J］.J Neurosurg， 2000， 92 (1): 108120.

　　［5］Masada T，Hua Y，Xi G，et al.Overexpression of interleukin1 receptor antagonist reduces brain edema induce by intracerebral hemorrhage and thrombin［J］.Acta Neurochir Suppl， 2003， 86: 463467.

　　［6］Ali C， Nicole O， Docagne F， et al.Ischemia induced interleukin6 as apotential endogenous neurop ro tective cytokine against NMDA recep to rmediated excito to xicity in the brain［J］.Cereb Blood Flow Metab， 2000，20: 956966.