用高胰岛素正糖钳夹技术研究人参皂甙对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠中PI3K的影响

【摘要】 探讨人参皂甙对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠中PI3K的影响。［方法］运用高胰岛素正糖钳夹技术检测2型糖尿病胰岛素抵抗模型大鼠，通过数学模型计算出葡萄糖输注速率(GIR)。［结果］三组人参皂甙组GIR均较高脂组不同程度的提高，人参皂甙Re组的GIR和正常组、高脂组有显著性差异。以 Wstern Blot方法测定肝脏组织中PI3K的含量，Rg1组的蛋白表达要比Rb1组、Re组、高脂组、对照组和正常组有显著性差异。［结论］ 人参皂甙在肝脏中有显著的促进PI3K磷酸化的作用。

【关键词】 高胰岛素正糖钳夹技术；糖尿病；人参皂甙； PI3K

　　Abstract:［Objective］ With hyperinsulinemic euglycemic clamp technique to insulin resistance of rat model，observe ginsenoside treat type 2 diabetes.［Methods］ pide the rats into 6 groups， feed through the high fat diet， cause the type 2 diabetes model， after feeding for 4 weeks ， through clamp calculate glucose infusion rate， observe the change of the weight of every group ， fetch the muscle， adipose organize and liver organize， regard PI3K as object albumen ， observe expression of albumen to come with immune trace with western blot. ［Result］ The GIR of ginsenoside Re and Rg1 increases and has significant differences with group Rb1 by the look of GIR， high with contrasting group’s comparative weight closely; in the liver organize taking PI3K as purpose albumen， the expression of the ginsenoside Rg1 group with other groups have significant differences ，P<0.05. ginsenoside Re and normal group ， ginsenoside Rg1 have significant differences， ginsenoside Rb1 has the significant difference with ginsenoside Rg1.［Conclusion］ Brief on the signal thorough fare where the ginsenoside can improve the insulin receptor (SRI ) notably of ginseng， promote the phosphoric acid of the insulin receptor， meanwhile， can promote PI3K signal to transfer to the glucose which leads the low reaches absorbing and transporting effectively.

　　Key words:hyperinsulinemic euglycemic clamp technique;diabetes; ginsenoside Re.Rb1.Rg1; Phosphoinositide3kinase (PI3K)

　　1 材料与方法

　　1.1 药物和试剂

　　人参皂甙由吉林大学有机教研室提供，马来酸罗格列酮（葛兰素史克公司07030088），优泌啉（人胰岛素）LILLY 埃及批号:HRE014肝素钠（75u/ml）加入0.9% Nacl 500ml（溶液中，共加入3支肝素（12500u/支），混匀，抽取5ml，配置PVP（6g）混匀，装入空瓶备用。磷酯酰肌醇3激酶抗(PI3K )（Cell Signaling Technology提供）、羊抗兔二抗 （ICL实验室提供），蛋白酶抑制剂（北京鼎国生物技术有限公司）罗氏甘油三酯/总胆固醇（TG/CHOL）配套试剂，操作严格按照说明书操作。

　　1.2 仪器

　　高速冷冻离心机（德国EPPENDORF公司）生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公司）日立全自动生化仪 7170 One Touch II微型血糖仪(美国Johnson公司产品)

　　1.3 动物分组

　　SD大鼠，雄性60只（中科院上海斯莱克实验动物有限责任公司），批号：scxk(沪)2003-0003。体重：180g左右。随机分成6组，每组10只，笼养一周，以适应环境。第二周开始，除正常组外，每组用高脂饲料喂养，自由取食，每只每天18g，每天给饲料前称量记录大鼠体重，同时，称量记录大鼠吃剩的饲料，喂养2周后，开始给药，对照组予罗格列酮6mg/（kg·d），灌胃，Rg1、Rb1、Re各组50mg/（kg·d），灌胃，连续灌服2周，给药期间，各组仍予高脂饲料喂养，自由取食，每天称量体重，造模形成大鼠高脂血症胰岛素抵抗2型糖尿病模型，更接近人的高脂血症引起的2型糖尿病。

　　1.4 插管

　　所有大鼠用3%戊巴比妥那腹腔麻醉（0.15ml/100g）。麻醉显效后，在无菌状态下切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌肉，显露、分离左右侧颈静脉，进行左右侧颈静脉插管，并将导管固定于肩胛部皮肤。用无菌锥型金属帽封堵导管口，缝合颈部皮肤。

　　1.5 高胰岛素

　　正常血糖钳夹术 将准备好的大鼠一侧颈静脉导管接上三通管的一端，三通管的另两端分别接上输注胰岛素和葡萄糖的输液管。另一侧颈静脉导管接上一细管，用于取血，接或以5ml空针(内有75U／ml的肝素溶液)注射以防凝血。首先从颈静脉抽取血液，用One Touch II微型血糖仪(美国Johnson公司产品)测定基础血糖2次，然后，以恒定的速率(25U／（kg·min)输注胰岛素。以后每10min测定血糖1次，当血糖值低于5.0mmol／L时开始输注25％葡萄糖。调整葡萄糖输注速率(Glucose infusion rate， GIR)，使血糖控制在4.5mmol／L(4.5至5.5 mmol／L)左右。90min后，当连续5次血糖值均在上述范围时，即认为达到了稳定状态。计算GIR =25%葡萄糖浓度×葡萄糖输入量（ml）/体重（kg）×时间（min），将数值记录在表格。

　　1.6 取材

　　大鼠取肝脏组织，以液氮冷冻后，存储予低温冰箱（-70℃）备用。

　　1.7 Western Blot蛋白制备

　　称取100mg组织置于10ml试管中，按正常组、高脂组、对照组、Rb1组、Re组、 Rg1组分别做好标记，加入1ml裂解液，于冰上匀浆。 将组织匀浆液迅速移入加40ul蛋白酶抑制剂的试管，混匀后，4℃，12000 rpm，离心15min。取上清至另一1.5ml试管中，-70℃保存2天，解冻，同上离心1min，取上清，将样本配制成蛋白量含量为50ug/16μl，-70℃的冰箱内贮藏备用。

　　1.8 Western Blot

　　采用SDSPAGE胶，10%下层胶10ml（水、30%丙烯酰胺、1.5M TRIS (PH 8.8)、10% SDS、10% 过硫酸铵、TEMED ） 4%上层胶4ml（水、 30%丙烯酰胺、1M TRIS (PH 6.8)、10% SDS、10% 过硫酸铵、TEMED）。将混合样本在100℃的水浴中变性5min，放入离心机离心2min，即得上样样本。待凝胶固定后，上样，（ 100V，电泳约 2.5h）。待电泳结束，将转膜夹放入转膜槽中转膜，恒定电流300mA ，1小时。5%脱脂奶粉封闭，摇床半小时。加入稀释好的一抗（1∶1000），4℃ 过夜。洗膜3次，加入稀释好的二抗（1∶500），常温，1h。洗膜3次， ECL液中定影。

　　1.9 统计学方法

　　用SPSS11.5统计软件，各组间采用方差分析，数据用x±s表示。

　　2 结果

　　2.1 各组钳夹实验后GIR的比较

　　见表1。表1 各组钳夹试验后的GIR比较（略）

　　与正常组比较， ☆P<0.05有显著性差异;与高脂组比较，★P<0.05

　　2.2 各组钳夹实验后TG/CHOL的比较

　　见表2。表2 各组钳夹试验后TG/CHOL比较（略）

　　与正常组比较， ☆P<0.05有显著性差异;与高脂组比较，★P<0.05

　　2.3 分组喂养后体重变化

　　见表3。表3 喂养后各组大鼠体重变化(略)

　　与正常组比较， ☆P<0.05;与高脂组比较，★P<0.05

　　2.4 western blot的结果

　　见表4，图1。表4 PI3K在组织中的灰度值表达（略）

　　与正常组比较， ☆P<0.05;与高脂组比较，★P<0.05 ;与对照组比，△P<0.05

　　3 讨论

　　胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是指胰岛素维持正常血糖的能力下降，其产生的生物学效应低于正常水平，或组织对胰岛素的反应性下降。［13］正常血糖高胰岛素钳夹技术是在动物清醒状态时，机体对高胰岛素刺激所产生的应激反应，能更准确地反应机体整体对胰岛素敏感的作用，而不局限于某一脏器，通过测血液中血糖的变化，来观察机体对高胰岛素刺激后各脏器的综合代谢，给药组由于增强了胰岛素的敏感性，减少了胰岛素的抵抗，三组人参皂甙组GIR均较高脂组不同程度的提高，人参皂甙Re组的GIR和正常组、高脂组有显著性差异，接近西药罗格列酮的GIR，但尚未达到正常组的水平。其机制可能和人参皂甙Re 能促进肝释放葡萄糖的能力及促进周围组织利用葡萄糖的能力增强。Re能促进胰岛素首先与靶细胞表面的胰岛素受体(IR)结合，激活受体β亚单位(IRβ)的酪氨酸激酶，然后导致一系列胰岛素受体底物(IRS)的磷酸化，尤其是IRS1和IRS2的酪氨酸磷酸化在胰岛素介导的细胞内信号转导中起关键作用，磷酸化的IRS可激活至少包括磷酯酰肌醇3酶(PI3K)（即IRS/PI3K途径）和有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)两个信号转导途径，从而在组织中引发最终导致胰岛素的生物效应［4］。

　　本实验中人参皂甙Rg1在肝脏组织中能促进PI3K的磷酸化，在肝脏组织中人参皂甙Rg1的抗胰岛素抵抗作用要优于Rb1组、Re组和对照组；而Rb1组、Re组和对照组在肝脏组织中仅有促进PI3K磷酸化的趋势，高于高脂组，说明人参皂甙在肝脏组织中有显著的促进PI3K磷酸化的作用。从而提高细胞对葡萄糖的摄取量，从受体后水平上改善胰岛素抵抗。

参考文献

1］张智慧，张梅.胰岛素抵抗的研究进展［J］.医学综述，2007，13(24)：19971998.

　　［2］罗四川，李启富，刘红梅.清醒状态大鼠高胰岛素正常血糖钳夹术的建立及其意义［J］.重庆医科大学学报，2004，29(3):334336.

　　［3］贾伟平.扩展高胰岛素正葡萄糖钳夹技术的建立［J］.中华内分泌代谢杂志，2001，17(5)：268271.

　　［4］李晨钟.Wistar大鼠的正常血糖高血浆胰岛素钳夹技术［J］.重庆医科大学学报，1998，23(2)：149152.