TGFβ1、wtp53基因在前列腺癌组织中的表达及其临床意义

　　　　　　 作者：苏振波 梁作文 洪泉 赵丹 王伟华

【摘要】 目的 探讨TGFβ1、wtp53基因在前列腺癌组织中的表达并探讨其临床意义。方法 应用免疫印迹技术检测正常前列腺、前列腺癌组织和癌旁组织中TGFβ1，wtp53基因的表达。结果 正常前列腺外腺和癌旁组织间的TGFβ1、wtp53表达水平无差异(P>0.05);前列腺癌组织中TGFβ1和wtp53表达，与正常前列腺组织和癌旁组织相比差异显著(P<0.01);已有远处转移灶的前列腺癌组织中TGFβ1和wtp53表达，与无转移灶者相比差异显著(P<0.01)。结论 TGFβ1和wtp53基因与前列腺癌的发生和转移相关，并可能在前列腺癌的进展中起重要作用。因此，借助测定TGFβ1与wtp53表达可辅助前列腺癌的诊断和评估预后。

【关键词】 前列腺癌;TGFβ1;wtp53;免疫印迹法

　　【Abstract】 Objective To detect the expressions of TGFβ1 and wtp53 gene in prostate carcinoma and evaluate its significances.Methods Western blotting method was used to detect TGFβ1 and wtp53 expression in the normal and carcinomous prostatic tissues.Results TGFβ1 was similarly expressed in the normal and prostatic paraneoplastic tissues(P>0.05)，and so was wtp53(P>0.05). Either TGFβ1 or wtp53 was differently expressed in the carcinomous prostatic tissues compared with normal or paraneoplastic tissues(P<0.01).The expressions of TGFβ1 or wtp53 were statistically different between metastatic prostate carcinoma and nonmetastatic carcinoma(P<0.01).Concmusions TGFβ1 and wtp53 genes are related to the malignant transformation and metastatis of prostate carcinoma.To detect the expressions of TGFβ1 and wtp53 may make for judging prostate cancer′s diagnosis and prognosis.

　　【Key words】 Prostate cancer;TGFβ;wtp53;Western blotting

　研究表明前列腺癌的发生是基因调控失衡的结果，其生物学特性与多种癌基因、生长因子密切相关〔1～4〕。转化生长因子(TGF)β1有促进肿瘤侵袭、转移、血管增生以及免疫抑制等多种作用〔1〕。野生型p53(wtp53)是肿瘤抑制基因，突变后则是典型的显性癌基因，具有致癌的作用〔2〕。本研究运用免疫印迹技术分别检测了TGFβ1及wtp53基因在前列腺癌组织中的表达，并探讨其临床意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本来源 2005年10月至2008年4月本院经直肠前列腺穿刺活检和手术切除后液氮保存的标本均经病理组织学确诊。前列腺癌36例(其中经影像学诊断为有远处转移的为24例)，年龄46～82岁。正常前列腺6例作对照。

　　1.2 主要试剂 兔抗人TGFβ1、p53多克隆一抗，羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗，均购自武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Western标志物是国产预染蛋白标志物。溴化乙锭、琼脂糖、SDS、TEMED、丙烯酰胺、N，N二甲基双丙烯酰胺、DTT、PMSF购自美国Sigma公司;DEPC 购自德国Merk公司;其他常规化学试剂均为分析纯产品。

　　1.3 主要仪器 凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);蛋白质电泳装置及转移系统(Biorad，美国)。

　　1.4 wtp53、TGFβ1的蛋白表达

　　1.4.1 总蛋白提取 将液氮低温保存的前列腺组织、前列腺癌及癌旁组织剪碎后各取100 mg，分别加入500 μl蛋白裂解液，4℃，15 000 r/min匀浆后200 r/min离心15 min。上清移入另一管中，20 000 r/min离心60 min。弃上清，取沉淀重新悬浮于200 μl匀浆缓冲液中，加蛋白提取液，充分混匀，沸水加热变性10 min。应用蛋白分析试剂(BioRad，USA)测定蛋白浓度。

　　1.4.2 SDSPAGE电泳 配制SDS聚丙烯酰胺凝胶，固定于电泳装置，加入Tris甘氨酸电泳缓冲液，排除凝胶底部两玻璃板之间的气泡，向加样槽中加入各个样品(蛋白粗提液，含蛋白质40 μg)及蛋白标志物各25 μl，电压75 V，电泳30 min，然后120 V，1 h。电泳完毕后取出凝胶，用电转膜仪将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，加封闭液封闭，室温2 h;加第一抗体，4℃温浴2 h;用250 ml TBST洗3次，每次10 min;加入第二抗体，室温1 h;用TBST洗涤3次，每次10 min;用DAB显色。

　　1.4.3 半定量结果分析 利用天能图像分析系统对显色结果拍照，记录电泳条带净光密度和强度值，以目的基因与内参βactin比值确定其含量计算其表达的相对丰度。

　　1.5 统计学处理 计量资料以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行组间的t检验。

　　2 结 果

　　2.1 免疫印迹结果 TGFβ1在相对分子量23 kD、wtp53为53 kD处出现特异性条带，βactin在42 kD处显影。见图1。

　　2.2 TGFβ1、wtp53蛋白表达量分析 分析电泳条带光密度值，计算目的基因表达的相对丰度=(目的条带的强度×净光密度)/(βactin条带的强度×净光密度)。正常前列腺外腺和癌旁组织间的TGFβ1、wtp53表达无差异(P>0.05);前列腺癌组织中TGFβ1和wtp53表达，与正常前列腺组织和癌旁组织相比差异显著(P<0.01);已有远处转移灶的前列腺癌组织中TGFβ1和wtp53表达，与无转移灶者相比差异亦显著(P<0.01)。见表1。表1 半定量测定TGFβ1、wtp53的蛋白产物的光密度比值1)与外腺组织比较，2)与无转移前列腺癌组织比较： 均P<0.01

　　3 讨 论

　　2000年以来，吉林大学前列腺疾病防治研究中心应用血清前列腺特异性抗原和经直肠B超引导下前列腺穿刺活检对吉林地区21 000余名50岁以上男性进行前列腺癌集团筛查，癌发现率为1.7%，中晚期病例超过42%，其中18%以上伴有骨转移〔5〕。应用免疫印迹技术检测特定蛋白，间接反映基因的表达活性，是研究癌相关基因的一种准确可靠的方法。

　　TGFβ1作为TGFβ细胞因子超家族的成员调节多种靶基因的表达，在胚胎生长发育、细胞分化、增殖及凋亡的调节中发挥着重要作用，同时参与细胞外基质的分泌和发育分化等多种生理过程。TGFβ1是一种抑癌基因，能抑制上皮细胞的增生，诱导凋亡;在癌组织中高表达，但因其表达和激活方式的缺陷，以及TGFβ1受体或受体后水平缺陷，导致生长抑制作用消失，却通过刺激致癌基因，抑制宿主免疫功能〔1〕，同时还刺激肿瘤血管生成、侵袭、转移〔3〕，从而加速肿瘤的生长和转移。因此，TGFβ1是作为肿瘤抑制基因和癌基因的双重角色存在的，研究表明TGFβ1信号通路的异常与肿瘤的发生、肿瘤细胞的浸润及转移密切相关，也有报道TGFβ1在恶性程度较高、对非激素依赖型前列腺癌中表达水平明显高于分化状态较好、对激素治疗敏感的前列腺癌，还可刺激成骨细胞，在前列腺癌骨转移中起作用〔4〕。

　　p53基因定位于17q13.1上，是一种抑癌基因，编码由393个氨基酸残基组成的蛋白质，即野生型p53(wtp53)。当射线或其他因子致DNA损伤时，wtp53大量增加，激活p21，使细胞周期停滞，修复受损DNA;若细胞已进入S期，已不能修复受损DNA，则wtp53 启动细胞凋亡控制程序。细胞凋亡被认为是某些类型的细胞对DNA损伤作出的应激反应，而该过程依赖于wtp53基因的存在。wtp53基因有诱导凋亡的作用，对bcl2基因和丛生蛋白(Clusterin)基因表达有下调作用，而对Bax基因进行上调。在50%的肿瘤细胞中存在p53突变，是基因改变频率最高的目标基因〔2〕。wtp53基因发生突变时可产生突变型p53(mtp53)蛋白，mtp53蛋白可抑制wtp53活性或使之失活，而且p53突变体失去了诱导凋亡的功能〔6〕，从而引起细胞的转化和癌变，Qian等〔7〕认为在前列腺癌中染色体不稳定性是一种共同特征。wtp53缺失可能是前列腺上皮内瘤样变转变成前列腺癌的一种机制，wtp53的缺失与前列腺癌进展有关，并且是生存潜能的指标〔8〕。

　　本研究通过Western印迹半定量测定TGFβ1、wtp53基因所表达蛋白水平，证实TGFβ1在前列腺癌组织表达水平高于癌旁组织和正常组织，wtp53则在癌组织中低表达;并且在已有远处转移的癌组织中TGFβ1表达明显高于未转移者，wtp53却低于未出现转移者。说明随着前列腺上皮细胞恶变和远处转移，TGFβ1基因表达有逐渐增高趋势，wtp53则相反，它们可作为重要指标判断前列腺癌的临床进展情况和预后。

参考文献

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　　2 Pardali K，Moustakas A.Actions of TGFbeta as tumor suppressor and prometastatic factor in human cancer〔J〕.Biochim Biophys Acta，2007;1775(1)：2162.

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　　5 王 尧，王伟华，计国义，等.吉林地区超声引导经直肠前列腺活检513例报告〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(19)：19267.

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　　7 Qian J，Hirasawa K，Bostwick DG，et al.Loss of p53 and cmycover representation in stage T(23)N(13)M(0) prostate cancer are potential markers for cancer progression〔J〕.Mod Pathol，2002;15(1)：3544.

　　8 Athar M，Back JH，Kopelovich L，et al.Multiple molecular targets of resveratrol：anticarcinogenic mechanisms〔J〕.Arch Biochem Biophys，2009;486(2)：95102.