胃癌组织中EphA2基因的表达及其与细胞凋亡、增殖的关系

　　　　 作者：刘辉 郭建文 刘江惠 张杰英 左连富

【摘要】 目的 探讨EphA2基因在胃癌组织中表达的生物学意义及与细胞凋亡、增殖的关系。方法 利用免疫组织化学法(immunohisochemistory，IHC)检测82例胃癌手术切除标本的癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜中EphA2的表达，采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)及Western印迹技术对其中随机选取的30例标本进行EphA2 mRNA及其蛋白的定量检测，分析其表达与临床病理参数的关系。采用流式细胞术(FCM)检测82例癌组织中细胞凋亡率及增殖指数(PI)，分析EphA2表达与细胞凋亡、增殖的关系。结果 IHC结果显示EphA2在癌组织中的表达显著高于癌旁组织及正常胃黏膜(P<0.01)，且随胃癌分化程度降低、浸润深度增加及淋巴结转移而升高(P<0.05)，但与肿瘤大小、患者年龄无关(P>0.05);RTPCR结果显示EphA2 mRNA在各组中的表达水平无显著性差异(P>0.05);Western印迹与IHC结果一致，显示EphA2蛋白在癌组织中异常高表达(P<0.01)。FCM结果显示EphA2高表达组细胞凋亡率显著低于低表达组(P=0.018)，而其PI显著高于低表达组(P=0.002)。结论 EphA2在胃癌组织中表达明显上调，可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，在胃癌的发生发展中发挥重要作用，其机制与EphA2 mRNA的转录异常无关，而可能是其翻译水平上调或蛋白质稳定性增高所致。

【关键词】 胃癌;EphA2;细胞凋亡;细胞增殖

　　【Abstract】 Objective To investigate the biological significance of EphA2 expression in human gastric carcinoma and its relationship with cell apoptosis and proliferation. Methods Expressions of EphA2 protein in carcinoma tissues， adjacent tissues and normal gastric mucosa were examined by immunohisochemistory (IHC) in 82 patients with gastric carcinoma and then the expressions of EphA2 mRNA and protein were detected by RTPCR and Western blot in 30 cases selected randomly. The relationship between expressions of EphA2 mRNA and protein and clinic pathological parameters was analyzed. The apoptotic ratio and proliferation index (PI) were determined by flow cytometry (FCM) in 82 cases of carcinoma tissues. The relationship between EphA2 expression and cell apoptosis and proliferation was analyzed. Results EphA2 expression increased in carcinoma tissues compared with that of adjacent tissues and normal gastric mucosa (P<0.01) by ICH and was related to histological differentiation， depth of infiltration and lymphatic metastasis (P<0.05) but not diameter of tumor and age of patients (P>0.05). The expressions of EphA2 mRNA in each group had no statistical difference (P>0.05) by RTPCR. Western blot results indicated the abnormal high expression of EphA2 protein in carcinoma tissues (P<0.05) with the similarity in IHC. FCM results indicated the apoptotic ratio of high expression of EphA2 cases was significantly lower than that of low expression ones (P=0.018). But the PI of high expression of EphA2 cases was significantly higher than that of low expression ones (P=0.002). Conclusions Over expression of EphA2 in gastric cancer may inhibit cell apoptosis and promote cell proliferation， and plays an important role in the carcinogenesis and metastasis of gastric carcinoma. Its mechanism may not be related to the level of mRNA， which may result from the upregulation in translational level or the increased protein stability.

　　【Key words】 Gastric carcinoma; EphA2; Apoptosis; Cell proliferation

　　受体酪氨酸蛋白激酶(Receptor tyrosine kinases，RTKs)是细胞信号转导通路中的关键分子组成，在细胞增生、分化及胚胎发育过程中发挥重要作用。促红细胞生成素产生肝细胞受体(erythropoietin producing hepatoma cell line，Eph)家族是最大的RTKs家族成员，至今Eph基因家族已有16个成员，EphA2是被发现具有酪氨酸激酶活性的第一个基因。研究发现〔1～3〕，EphA2受体的过表达与许多恶性肿瘤的生长、恶性程度及转移侵袭有关，在肿瘤临床的早期诊断、治疗和预后判断中可能潜在巨大价值。目前，研究胃癌中EphA2表达的报道较少，且其在肿瘤发生发展中的异常表达机制还需进一步阐明。本实验采用免疫组织化学法(IHC)、逆转录聚合酶链反应(RTPCR)及Western印迹法，检测胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜中EphA2 mRNA及其蛋白的表达，分析其与临床病理特征的关系，并利用流式细胞术(FCM)检测癌组织中细胞凋亡率及增殖指数(PI)，探讨EphA2表达与细胞凋亡、增殖的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 收集本院2007年1月至7月间胃癌手术切除标本82例，其组织学类型均为腺癌，其中男70例，女12例，年龄22～80〔平均(59±21)〕岁，术前均未经过放、化疗。每例标本分别取癌组织、癌旁组织(距癌边缘1.5～2 cm)及正常胃黏膜(距癌肿边缘5～10 cm以上)，固定于10%中性福尔马林溶液，石蜡包埋切片，供免疫组化染色。总标本中随机选取30例，于同一部位取材，置于液氮中保存，供RTPCR和Western印迹检测。另取每例标本的癌组织固定于70%乙醇中，4℃保存，供FCM检测。

　　1.2 主要试剂 EphA2(clone C20)兔抗人多克隆抗体，购于Santa Cruz公司。免疫组化二抗试剂盒(SP9000)，购于北京中杉生物技术有限公司。羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)二抗，购于Santa Cruz公司。PCR引物由上海杰瑞公司合成。反转录试剂盒及Taq酶试剂，购自美国Promega公司。

　　1.3 IHC检测 按SP试剂盒说明书进行，EphA2一抗稀释浓度为1∶100。设立阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。免疫组化判断标准：EphA2为胞浆(胞膜)着色，根据显色强度分为0～3级〔4〕：0级：阴性(-)，细胞无棕黄色染色;1级：弱阳性：(+)，细胞染色较淡;2级：阳性()，细胞中度染色;3级：强阳性()，细胞染色较深。

　　1.4 RTPCR检测 采用Trizol细胞裂解法提取组织RNA，测定样品RNA在波长260和280 nm处的吸光度比值，检测其纯度和浓度。EphA2的引物序列：上游引物序列为5′CCAAGTTCGCTGACATCGT3′，下游引物序列为5′GCCATGAAGTGC TCCGTAT3′，扩增产物大小为196 bp。内参照GAPDH引物序列：上游引物序列为5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游引物序列为5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增产物大小为486 bp。cDNA合成条件：取1 μg提取RNA加入20 μl的反应体系中，25℃ 10 min，42℃ 1 h，99℃ 5 min。PCR扩增条件：逆转录产物用无核酸酶的水稀释至100 μl，取20 μl用于扩增，94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，共34个循环;72℃ 7 min，4℃保存。同管扩增GAPDH作为内参基因。取10 μl PCR 产物经2%琼脂糖电泳鉴定，美国Image公司缓冲液冷却循环器(Fotodyne)凝胶图像分析系统摄片并分析其光密度，结果以目的基因与内参基因吸光度的比值表示。

　　1.5 Western印迹分析 各组织块在细胞裂解液中匀浆(每100 mg组织加400 μl RIPA裂解液)，蛋白质定量后，每泳道以200 μg蛋白量上样到SDSPAGE凝胶中电泳2 h，而后用半干转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上，置于5%脱脂奶粉的TBS液中封闭2 h。室温下加入一抗EphA2(1∶100)，4℃过夜。TBS洗膜后，加入羊抗兔HRP二抗(1∶10 000)，37℃孵育1.5～2 h。将PVDF膜置于化学发光仪内发光，图像存盘。采用美国Kodak公司ID凝胶成像分析系统对各区带进行定量分析。

　　1.6 细胞凋亡和增殖FCM法 碘化丙啶一步插入性DNA定量荧光染色法：PBS洗涤样品，调整每份样品的细胞数为1×106/ml。每份样品中加入DNA染色液(碘化丙啶 50 mg/L，RNA酶10 mg/L，Triton×100 1.0%)1.0 ml，置于4℃冰箱，染色30 min，以500目筛网过滤，使样品成为合格的单细胞悬液，即可上机检测。以二倍体峰(G0/G1)前出现亚G1峰表示凋亡细胞峰位，根据亚G1峰的分布组方图计算细胞凋亡率。利用DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数(PI)表示细胞的增殖活性，PI=(S+G2/M) /(G0/G1+S+G2/M)。

　　1.7 统计学方法 采用 SPSS11.5 统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较分别采用χ2检验、方差分析及t检验。

　　2 结 果

　　2.1 EphA2的表达及与临床病理特征的关系(IHC) EphA2阳性表达于胞浆(胞膜)，呈棕黄色颗粒。癌组织中EphA2的表达显著高于癌旁组织和正常胃黏膜(P<0.01)。在癌组织中，随分化程度的降低、浸润深度的增加及淋巴结转移，EphA2表达显著升高(P<0.05);在肿瘤直径<5 cm与≥5 cm两组间、<60岁和≥60岁两组间EphA2表达无显著性差异(P>0.05)，在性别组中，各级别组理论数均小于5，无法统计故舍弃。见表1，2，图1。表1 EphA2在各组织中的表达表2 EphA2的表达水平与临床病理学特征的关系(n)

　　组别n-+P分化高分化30391260.019中低分化52371626浸润深度浅层2048350.017深层621220291淋巴结转移有514516260.009无31211126肿瘤直径<5 cm5131118190.914≥5 cm31351013年龄<60岁433914170.946≥60岁39371415性别男706162127女120075

　　2.2 EphA2 mRNA的表达及与临床病理特征的关系(RTPCR) 在所有样本中均检测到EphA2 mRNA的表达，其在癌组织(1.449±0.615)、癌旁组织(1.139±0.477)和正常胃黏膜(1.132±0.359)中的表达水平无显著性差异(P>0.05)。EphA2 mRNA的表达与胃癌临床病理参数无关(P>0.05)，见表3，图2。

　　2.3 EphA2蛋白的表达及与临床病理特征的关系(Western印迹) 癌组织中EphA2蛋白表达量(2.168±0.348)显著高于癌旁组织(1.301±0.258)和正常胃黏膜(0.530±0.110)(P=0.000)，癌旁组织EphA2蛋白表达量显著高于正常胃黏膜(P<0.01)。EphA2蛋白的表达与癌组织的分化程度、浸润深度有关(P<0.05)，但与淋巴结转移、肿瘤直径、患者年龄及性别无关(P>0.05)，见表3，图3。表3 EphA2 mRNA和蛋白的表达与临床　病理学特征的关系

　　2.4 EphA2表达与细胞凋亡、增殖的关系 按免疫组化检测结果将82例癌组织标本分为EphA2高表达组(～)和EphA2低表达组(-～+)，FCM结果发现EphA2高表达组细胞凋亡率(10.51%±3.49%，n=22)显著低于低表达组(12.27%±4.35%，n=60，P=0.018)，而EphA2高表达组PI值(56.72%±15.91%，n=22)显著高于低表达组(41.83%±19.44%，n=60，P=0.002)。

　　3 讨 论

　　从细胞表面到细胞核的信号转导途径一直是人们十分关心的研究热点。RTKs是外界刺激信息传递至细胞核，转化成细胞效应通路中的关键分子组成。具有酪氨酸激酶活性的EphA2受体是从人上皮角化细胞cDNA文库中筛选得到的一个Eph亚家族成员，广泛表达于上皮来源的细胞，包括皮肤表皮、肠道上皮、肺和卵巢组织〔5〕。研究表明〔6，7〕，EphA2可具有双重作用：正常低表达时，EphA2可通过胞外配体结合区与其配体EphrinAl结合，形成受体配体复合物，作用于细胞内的信号转导分子，抑制细胞增生，维持细胞间良好的黏附性，调节正常细胞的生长、迁移;而当EphA2高表达和功能异常时，无法发挥正常的信号转导作用，反而促进细胞的恶性转化，促进癌组织的浸润和转移。目前的研究发现，EphA2可高表达于多种恶性肿瘤组织，包括乳腺癌〔8〕、膀胱癌〔9〕及卵巢癌〔10〕等，尤其高表达于高侵袭性的肿瘤细胞。为了探讨EphA2基因在胃癌组织中的表达情况，分析其与胃癌临床病理特征的关系，本文结果提示EphA2异常表达与肿瘤的恶性程度和侵袭转移密切相关，但其高表达未能在mRNA水平上证实，提示可能与其mRNA的转录异常无关。

　　相关研究发现〔11～13〕，EphA2 mRNA在某些肿瘤细胞中的表达水平，并不随肿瘤恶性度的增大、侵袭性的增加而升高，或者与EphA2蛋白相比不成比例升高，这与本实验结果一致。因此，推测EphA2在胃癌组织中异常高表达的原因可能与翻译水平上调或蛋白质稳定性增高有关。

　　细胞凋亡与增殖的比例失衡在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。目前，关于EphA2高表达对肿瘤细胞凋亡与增殖的影响还存在争论，张立智等〔14〕发现，EphA2可促进骨肉瘤细胞的增殖，抑制其凋亡，而Jin等〔15〕认为EphA2是p53及其家族成员的靶基因，可诱导细胞凋亡。本实验结果表明EphA2高表达可显著降低胃癌细胞调亡率，提高其PI，显示其抑凋亡、促增殖作用，EphA2有望成为一个胃癌临床诊治的新靶点，对其结构、功能的深入研究将具有重要意义，但关于其信号转导机制尚需进一步研究阐明。

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