FAP和TGFβ1在肺腺癌中的表达及临床意义

【摘要】 目的 研究成纤维细胞激活蛋白(FAP)和转化生长因子β1(TGFβ1)在肺腺癌中的表达及临床意义。方法 应用免疫组织化学SP法检测40例肺腺癌组织中FAP和TGFβ1表达情况，结合临床分期和病理分级进行分析。结果 40例肺腺癌间质中FAP表达阳性率为90%，正常肺组织中无表达;FAP的表达与肺腺癌的临床分期有关，与病理分级无关。40例肺腺癌组织中TGFβ1表达阳性率87.5%，其表达与临床分期和病理分级有关。FAP与TGFβ1阳性表达呈正相关。结论 FAP和TGFβ1共同作用于肺腺癌，促进癌细胞的增殖和浸润，与其恶性程度、临床分期相关，联合检测有助于确定肺腺癌的恶性程度和估计预后及综合治疗方案的制定。

【关键词】 肺腺癌;成纤维细胞激活蛋白;转化生长因子

肺腺癌多为周围型，生长缓慢，早期即可发生转移。近年来，肿瘤间质中的成纤维细胞被认为主动参与并调节肿瘤的演进。根据体外研究推测，在成纤维细胞上特异性表达的成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)可能与肿瘤的生长侵袭有关〔1〕。在多种肿瘤组织中，转化生长因子β1(TGFβ1)表达增高，参与肿瘤增殖、分化、凋亡等病理生理过程，并可促进反应性肿瘤间质的形成〔2〕，因此，TGFβ1可能与FAP的表达有关。在肺腺癌中联合检测FAP和TGFβ1表达尚少有报道。本研究通过观察肺腺癌组织中FAP和TGFβ1的表达，分析其与肺腺癌临床病理参数间的相关性，为临床诊断、治疗、预后判定提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 收集2007年2月至2008年12月本院胸外科手术切除的肺腺癌标本共40例，均有详细的临床资料、手术记录，术前均未接受放疗和化疗。所有标本均经病理证实为肺腺癌。患者年龄36～75岁，平均年龄57.8岁，其中男13例，女27例。根据UICC肺癌TNM分期，Ⅰ期10例，Ⅱ期9例，Ⅲ期21例。病理学分级Ⅰ级12例，Ⅱ级13例，Ⅲ级15例。另收集10例肺大疱及肺部慢性炎症手术切除组织标本作为正常对照组(其中肺大疱4例，慢性炎症6例)。所有标本经10%福尔马林固定后，常规石蜡包埋和HE染色，5 μm切片。

　　1.2 主要试剂 兔抗人多克隆FAP抗体、小鼠抗人TGFβ1单克隆抗体(购自Abcam公司)，SP9001试剂盒、DAB试剂盒(购自北京中杉生物工程公司)。

　　1.3 方法 采用免疫组化SP法，严格按照试剂盒说明操作。PBS代替一抗做阴性对照，室温操作，切片脱蜡至蒸馏水，pH6.0的柠檬酸缓冲液微波修复10 min，自然冷却至室温，用PBS浸泡5 min×3次。3% h3O2封闭内源性过氧化物酶，室温20 min，PBS浸泡5 min×3次，加山羊血清50 μl/片，室温封闭内源性生物素20 min，甩除勿洗，滴加一抗50 μl/片(MMP2 1∶100;MMP9 1∶100)，4℃过夜，PBS浸泡5 min×3次。滴加二抗50 μl/片，室温30 min，PBS浸泡5 min×3次。滴加辣根酶标记卵霉链白素50 μl/片，室温30 min，PBS浸泡5 min×3次，DAB显色，显微镜下控制，自来水终止。苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中型树胶封片。

　　1.4 染色结果判定标准 随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞或者间质细胞，计数阳性细胞的百分比。无染色计0分，弱染色(淡黄色)计1分，中染色(棕黄色)计2分，强染色(褐黄色)计3分;细胞阳性数<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，>50%计3分。上述两项计分相加得出总分，0分为阴性(-)，1～2分为(+)，3～4分为()，5～6分为()。

　　1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件，进行R×C列联表χ2检验及四格表关联性分析。

　　2 结 果

　　2.1 FAP的表达 正常对照组肺组织中无阳性表达，在40例肺腺癌组织中表达阳性率为90%(36/40)，主要表达在肺间质成纤维细胞胞质内，呈棕黄色，与病理分级无关，与临床分期相关。部分肿瘤细胞也有少量阳性表达。见表1。

　　2.2 TGFβ1的表达 正常对照组肺组织中无阳性表达，在肺腺癌组织中表达于癌细胞胞浆中，呈棕黄色，阳性率为87.5%(35/40)，与病理分级和临床分期均有关。见表1。表1 FAP、TGFβ1在肺腺癌中的表达与病理、临床关系

　　2.3 FAP和TGFβ1表达相关性 40例肺腺癌组织中FAP、TGFβ1共阳性表达35例，共阴性表达4例，仅FAP阳性1例，仅TGFβ1阳性0例。经统计学分析，FAP与TGFβ1表达呈正相关(r=0.882，P=0.000)，即随着一个因子表达的增强另一个因子表达也增强。

　　3 讨 论

　　实体瘤(包括上皮细胞癌)，直径超过1～2 mm时就需要通过基质形成来获取肿瘤细胞存活和生长所必需的营养物质。这种起支持营养作用的基质需要活化的成纤维细胞〔3〕。

　　FAP是由Retting等1988年报道的应用单克隆抗体F19识别的一种膜抗原，最初被称为F19抗原，属于丝氨酸蛋白酶类。体外研究表明其具有分解明胶和Ⅰ型胶原的活性以及类似二肽基肽酶(DPP) 的活性，降解ECM，使肿瘤细胞脱离原来的位置，有利于肿瘤细胞的侵袭和远处转移〔1〕。另一方面，FAP还可能参与生物活性肽和趋化因子的裂解，从而参与肿瘤的侵袭转移以及组织重塑〔4〕。FAP抗原表达在多种恶性上皮肿瘤的间质细胞(如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、食管癌等)〔5，6〕，而在正常组织中的成纤维细胞和良性肿瘤间质中无阳性表达，提示其可能是一个增生性成纤维细胞的表面标志物，与恶性肿瘤的生长、浸润、侵袭有关〔2〕。

　　在本研究中，FAP阳性表达在肺腺癌间质的成纤维细胞胞浆中，在癌细胞中也有表达，与以往在宫颈癌和食管癌中的研究结果一致〔3，7〕。本组肺腺癌中FAP的阳性率为90%，随着肿瘤恶性程度的增高，表达无明显差异，而随着临床分期的增高，表达程度增高，其差异有统计学意义。这表明FAP与肺腺癌的演进程度有关，即肺腺癌随着浸润转移程度的增加，在肿瘤间质中的表达随之也增加。

　　TGFβ1是一个二聚体，分子量为25 000，由两条112肽通过两条链间的二硫键组成，能引起小鼠成纤维细胞产生表型转化，在机体的免疫调节、细胞生长和分化、细胞外基质的合成与贮存、胚胎发育、创伤修复、肿瘤免疫等方面起着重要作用〔8〕。目前已知TGFβ存在5种形式，TGFβ1种属间有明显的序列同源性(>96.5%)，提示其介导独特的、保守的生理过程。哺乳动物体内主要存在TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3 3种形式，其中，TGFβ1 是人体内主要的存在形式。

　　研究表明，TGFβ1 通过以下通路调控细胞的生长与分化〔9，10〕:TGFβ1 在胞浆中合成后，与潜活蛋白结合，以无生物活性的潜活形式被分泌到细胞外，当某种因素使TGFβ1 与潜活蛋白分离，被激活的TGFβ1 则通过自分泌或旁分泌的形式，与靶细胞膜上特异的TGFβ受体结合形成复合物，受体因此被激活，其细胞内GS 区磷酸化，结合并激活细胞内SMAD 族蛋白，将信号传递至细胞核内，启动靶基因转录，调控靶细胞的生长、分化、凋亡等，发挥其生物学功能。

　　TGFβ1与肿瘤细胞的关系尚未确定，Cui等〔11〕研究发现其可抑制皮肤良性肿瘤的形成，但可促进其恶变。因此有报道认为在肿瘤发生早期TGFβ1抑制肿瘤细胞的增殖，而在中后期可能促进肿瘤细胞生长〔12〕，其详细机制尚不完全清楚。

　　本研究中，TGFβ1表达于肺腺癌细胞的胞浆中，阳性率为87.5%，与癌细胞的分化程度和临床分期均相关，即随着肿瘤细胞恶性程度和临床分期的增加，TGFβ1表达增强，与在肾癌中的相关报道不完全一致〔13，14〕，与在肺鳞癌细胞中的研究报道一致〔15〕。因此，TGFβ1可能成为确定肺腺癌恶性程度和估计预后的一个有效指标。

　　TGFβ1 是重要的上皮细胞生长负性调节因子，可诱导细胞凋亡;其以自分泌和旁分泌两种方式与靶细胞表面相应受体( TGFβRⅠ、Ⅱ) 结合发挥生长抑制功能，但是可通过诱导细胞csis基因编码PDGF的B链二聚体起作用，促进成纤维细胞的增殖〔16〕。虽然目前体内诱导FAP表达的机制尚未完全明了，但这可能是促进FAP表达的一种机制。有研究证明TGFβ1可诱导体外培养的胎儿脑膜成纤维细胞FB20 表达FAP 增加〔17〕。本研究中FAP与TGFβ1表达呈正相关，与上述结论一致。

　　综上，FAP和TGFβ1共同作用于肺腺癌，促进癌细胞的增殖和浸润，与其恶性程度、临床分期相关，联合检测有助于确定肺腺癌的恶性程度和估计预后，为肺癌的综合治疗提供有益的帮助。但二者在体内联系的详细分子机制仍有待进一步研究。

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