MMP2和VEGF在骨软骨瘤、骨巨细胞瘤和骨肉瘤组织中的表达及临床意义

【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶2(MMP2)及血管内皮生长因子(VEGF)在软骨瘤、骨巨细胞瘤和骨肉瘤组织中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化法检测MMP2和VEGF在骨软骨瘤、骨巨细胞瘤和骨肉瘤组织各20例中的表达，并分析其与年龄、性别和复发、转移等因素的关系。结果 VEGF和MMP2在骨巨细胞瘤和骨肉瘤组的阳性表达率(60%，70%;90%，80%)明显高于软骨瘤组(25%，30%)(P<0.05，P<0.01)，且两者的表达有显著正相关性(P<0.05)。MMP2和VEGF的阳性表达与复发和转移显著相关(P<0.05，P<0.01)，与年龄和性别无关。结论 MMP2和VEGF可作为骨巨细胞瘤和骨肉瘤的预后指标。

【关键词】 基质金属蛋白酶2;血管内皮生长因子;骨软骨瘤;骨巨细胞瘤;骨肉瘤

近年的研究表明〔1，2〕，基质金属蛋白酶(MMP)和血管内皮生长因子(VEGF)与恶性肿瘤的侵袭及转移关系密切。已有报道VEGF和MMP2在骨肿瘤中存在高表达，而且与转移和复发关系密切〔3，4〕，但尚未见联合检测MMP2和VEGF在骨软骨瘤、骨巨细胞瘤和骨肉瘤组织中的表达及临床意义的报道。本实验拟采用免疫组化法，联合检测VEGF和MMP2在软骨瘤、骨巨细胞瘤和骨肉瘤组织中的表达，并分析其与年龄、性别和复发、转移之间的关系，比较两者之间的差异及相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料 骨软骨瘤、骨巨细胞瘤和骨肉瘤各20例患者均为2003年7月至2008年7月辽宁医学院附属第一医院骨科住院病人，术前均未行放疗和化疗，术后标本经病理证实诊断，术后常规治疗并定期复查，随访12～60个月，平均36个月。骨巨细胞瘤患者20例，男5例，女15例，年龄14～57岁，平均(27.85±11.09)岁;发病部位：股骨8例，胫骨4例，桡骨4例，腓骨3例，骶骨1例;术后复发8例，转移9例。骨肉瘤患者20例，男14例，女6例，年龄8～56岁，平均(24.15±13.39)岁;发病部位：股骨8例，胫骨8例，肱骨4例;术后复发16例，转移17例。软骨瘤患者20例，男8例，女12例，年龄4～62岁，平均(26.65±15.63)岁;发病部位：股骨8例，胫骨6例，肱骨2例，肋骨2例，肩胛骨1例，踝骨1例，术后无复发及转移。

　　1.2 免疫组织化学染色(SABC法) 术后组织立即用中性福尔马林固定，自动脱水，浸蜡，包埋。石蜡标本连续切片4张，4 μm 厚，1张HE染色，1张PBS代替一抗阴性对照。AntiMMP2和AntiVEGF兔抗人多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司，SABC组化试剂盒购自武汉博士德公司。按照试剂盒说明操作。

　　1.3 结果判断 光学显微镜下观察蛋白表达情况，照相。阳性结果为细胞胞浆或胞膜棕黄着色，随机选取5个高倍镜视野，计数方法采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统，按阳性细胞所占比例分为(-)：瘤细胞染色阴性或< 5% 的瘤细胞有少量着色;(+):5%～20%的瘤细胞呈弱阳性;()：21%～50% 的瘤细胞阳性;():>50%的瘤细胞阳性且着色较强。计数由病理科两位资深医生操作。

　　1.4 统计学分析 采用SPSS12.0统计软件，R×C表χ2检验及四格表χ2检验。MMP2、VEGF的相关性比较采用Linear Correlation相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 VEGF与MMP2的免疫组化结果 VEGF阳性产物呈棕褐色颗粒，主要定位于肿瘤细胞浆，部分血管内皮细胞质及细胞外基质也有弱阳性表达(图1)。VEGF在骨巨细胞瘤组和骨肉瘤组的阳性表达明显高于软骨瘤组(P<0.05，P<0.01);VEGF在骨肉瘤组的阳性表达亦高于骨巨细胞瘤组(P<0.05)(见表1)。MMP2阳性产物主要位于肿瘤细胞浆内及胞膜，呈棕黄色颗粒(图2);MMP2在骨巨细胞瘤组和骨肉瘤组的阳性表达亦明显高于骨软骨瘤组(P<0.05，P<0.01);MMP2在骨肉瘤组的阳性表达虽高于骨巨细胞瘤组，但无统计学差异(P>0.05)。表1 VEGF和MMP2在不同组织中的表达

　　2.2 不同组织中VEGF和MMP2表达的相关性 见表2。VEGF和MMP2共同阳性表达在软骨瘤组中4例，骨巨细胞瘤组中13例，骨肉瘤组中16例，经线性相关分析，软骨瘤组、骨巨细胞瘤组和骨肉瘤组VEGF和MMP2表达存在显著正相关(P<0.01)。

　　2.3 不同组织中VEGF和MMP2的表达与临床资料的关系 见表3。骨巨细胞瘤组中VEGF和MMP2的表达在性别和年龄方面无显著差异(P>0.05)，在复发和转移方面显著高于无复发和转移组(P<0.05，P<0.01)。骨肉瘤组中VEGF和MMP2的表达在性别和年龄方面无显著差异(P>0.05)，在复发和转移方面显著高于无复发和转移组(P<0.05，P<0.01)。表2 不同组织中VEGF和MMP2表达的关系　1)P<0.01图1 MMP2在不同组织中的表达(×200)表3 不同组织中VEGF和MMP2的表达与临床资料的关系

　　3 讨 论

　　骨肿瘤是指发生于骨骼的恶性肿瘤，可导致功能障碍，骨骼畸形及病理性骨折等，总体发病率虽不高，但常造成病人肢体残疾甚至危及生命，因此在骨科临床上占有极其重要的地位。骨软骨瘤是好发于青少年的良性肿瘤，手术治疗效果较好，很少复发和恶变，本组20例经随访无复发和恶变。骨巨细胞瘤和骨肉瘤是临床较为常见的骨肿瘤，随着人们预期寿命的延长和饮食习惯的改变，中老年人群的发病人数较前增多，尽管两者的发病年龄及临床病理特点各不相同，但都有较易复发或转移的特点。随着分子生物学的飞速发展，有关骨肿瘤的侵袭和转移的分子研究取得了很大进展。研究表明〔5，6〕，丰富的血管为肿瘤的生长和转移提供营养和物质条件，微血管的生成与肿瘤的持续性生长和侵袭转移有关。其中MMP和VEGF成为有关恶性肿瘤的侵袭及转移研究的热点和关键。

　　MMPs是一类Zn2+依赖的蛋白水解酶，能够降解所有的细胞外基质，在多种恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。MMP2能够降解明胶、层连接蛋白和E型胶原，广泛存在于恶性肿瘤中，以酶原形式分泌至细胞外基质中，有利于肿瘤细胞进入血管或淋巴管，还可间接释放与细胞外基质成分结合的生长因子，通过诱导血管生成，促进肿瘤增殖和转移，形成新的癌巢〔7〕。对不同类型肿瘤的研究表明，MMP表达和肿瘤分级、侵袭性、复发或转移风险有相关性。

　　VEGF是已证实的惟一对血管形成具有特异性的重要生长因子，其功能为：促进血管内皮细胞增殖、血管生成;增加血管通透性;作用于不同来源的内皮细胞使其形状改变并刺激增殖，且可刺激单核细胞及成骨细胞的迁移。实体肿瘤的血管新生与瘤细胞分泌的多种血管生长因子有关。在已发现的20多种多肽类血管生长因子中，VEGF针对内皮特异性最高。促泌方式通过调节内皮细胞整合素及蛋白酶激活因子的表达激活细胞内信号传导通路，增加微血管通透性等途径而诱导内皮细胞增殖和迁移，因此是一种内皮细胞特异的致分裂原，并参与肿瘤性基质形成及新生血管形成〔8〕。

　　本研究表明VEGF和MMP2在骨肉瘤和骨巨细胞瘤中均有高表达，阳性率略高于国内外报道，在软骨瘤中有低表达。而且VEGF在骨肉瘤中的表达亦高于骨巨细胞瘤，有统计学意义，而MMP2虽然在骨肉瘤中的表达亦高于骨巨细胞瘤，但无统计学意义。骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于滋养血管丰富、内部代谢活跃的长骨干骺端。实验证明，人类的许多恶性肿瘤中，包括骨肉瘤都发现有高水平的VEGF表达，且VEGFmRNA的表达均明显高于低度恶性肿瘤，特别是在肿瘤组织坏死区、高血管密度区更为明显。而骨巨细胞瘤是起源不明的肿瘤，具有局部侵袭性生长的倾向，有低度恶性潜能，极少发生于骨发育不成熟的个体。组织病理学显示，骨巨细胞瘤由成片肿瘤性卵圆形单核间质细胞和散在分布的破骨细胞样巨细胞构成。研究表明MMP2是成骨细胞和破骨细胞生长所必需的，当MMP2过表达和活性增强时，可引起骨质溶解和关节炎〔9〕。本文结果支持骨肉瘤比骨巨细胞瘤有更丰富的血运和更强的侵袭和转移能力。相关分析表明，VEGF和MMP2在骨肉瘤和骨巨细胞瘤中的表达具有正相关性，提示两者在骨肿瘤的侵袭和转移中可能发挥协同作用。有研究表明VEGF能诱导基质胶原酶在内皮细胞表达，改变细胞外基质，介导内皮细胞迁移和浸润，利于血管生成。而基质胶原酶的激活又可降解基质，尤其MMP2可将与VEGF形成复合物的促血管生成和有丝分裂细胞因子抑制剂解离，释放VEGF，从而促进新生血管生成。因而，两者的作用相辅相成。本研究结果与此一致。观察VEGF和MMP2在骨肉瘤和骨巨细胞瘤组织中的表达部位和分布特点，发现在骨巨细胞瘤中MMP2阳性物质主要位于单核间质细胞和多核巨细胞胞质内，且肿瘤边缘或增生活跃部位着色深，部分内皮细胞也着色。而在骨肉瘤中MMP2染色阳性主要位于肿瘤细胞浆内。VEGF在骨巨细胞瘤中呈胞质着色，以多核巨细胞多见，强阳性染色的瘤细胞多位于浸润边缘或细胞活跃增生区。在骨肉瘤中主要位于肿瘤细胞浆中，部分血管内皮细胞质及细胞外基质也有弱阳性表达。两者的表达部位和分布特点符合各自的病理特点。

　　通过分析VEGF和MMP2在骨巨细胞瘤和骨肉瘤组织中的表达与临床资料的关系，两者与年龄、性别无相关性，与转移和复发呈显著相关性。与国内报道基本一致〔3〕。提示VEGF和MMP2在骨巨细胞瘤和骨肉瘤的侵袭生长和远处转移中可能起协同作用。

　　目前骨巨细胞瘤和成骨肉瘤的治疗主要为手术治疗，但复发及转移率较高。笔者认为如能对术后组织联合检测VEGF和MMP2的表达，可有助于判断预后。如两者均高表达提示已有或极易发生转移和复发，应辅以其他治疗手段。对阴性表达者可定期复查，以早期发现病变。因此检测VEGF和MMP2可以作为判断骨肿瘤转移复发和预后的重要指标，同时也为研究通过VEGF或MMP2途径治疗骨肿瘤提供新的思路。

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