慢性阻塞性肺病患者细胞因子与氧自由基的相关性

　　　　　　 作者：王春雷 蔡日丹 康健 李振华

【摘要】 目的 探讨慢性阻塞性肺病(COPD)患者细胞因子与氧自由基相关性及对肺功能的影响。方法 选自2006年6月至2007年5月住院的COPD患者35例，急性加重期组20例(A组)，稳定期组15例(B组)，我院内科健康体检者10名作为对照(C组)。采用ELISA法检测血清中白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、肿瘤坏死因子(TNFα)的质量浓度。细胞色素C还原法测外周血中性粒细胞释放超氧阴离子(O2)水平。并分析O2水平与细胞因子及肺功能、血气之间关系。结果 A组IL6、IL8、TNFα水平显著高于B和C组(P<0.01)。A组及B组患者外周血中性粒细胞释放O2量显著高于C组(P<0.01)。A组患者外周血中性粒细胞释放超O2水平与其第1秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1占预计值百分比、FEV1/用力肺活量、动脉血压分压呈明显负相关(r分别为-0.539，-0.531，-0.542，-0.652，P均<0.01)。同时A组患者外周血中性粒细胞释放超O2水平与血浆IL6、IL8、TNFα浓度呈直线正相关(r分别为0.895，0.876，0.892，P均<0.01)。结论 COPD患者急性加重期炎症细胞在细胞因子等刺激下活化，释放氧化物质增多，对导致COPD急性加重期肺功能恶化可能起重要作用。

【关键词】 慢性阻塞性肺病;细胞因子;氧自由基;肺功能

慢性阻塞性肺病(COPD)发病机制复杂，其中氧化应激是COPD发病的重要机制之一。中性粒细胞是免疫系统的防御细胞，也是反应性氧代谢产物、炎症性细胞因子、脂质介质、抗菌肽以及损伤酶的来源之一〔1〕，它参与了慢性支气管炎的黏膜化生和肺气肿时肺组织的破坏。中性粒细胞释放超氧阴离子(O2)等活性氧代谢产物和蛋白酶，释放肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素8(IL8)、白介素6(IL6)等细胞因子，与其他炎症细胞(如巨噬细胞、气道上皮细胞)释放的炎症介质共同作用，促使更多的中性粒细胞活化、聚集，放大炎症，加重损伤〔2〕。本实验通过测定COPD患者血清细胞因子和氧自由基的变化，探讨细胞因子和氧自由基在COPD发病中作用。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 选自2006年6月至2007年5月住院的COPD患者35例，其中男28例，女17例，年龄61～87岁，平均年龄(67.9±5.8)岁，诊断符合2002年中华医学会呼吸分会慢性阻塞性肺疾病诊治指南规定的标准〔3〕，根据其病史、临床症状、体征、X线胸片、心电图、肺功能又将其分为：急性加重期组20例(A组)，为短期内咳嗽、咳痰、气短和(或)喘息加重痰量增多，伴发热的新入院患者;稳定期组15例(B组)，为急性加重期患者经吸氧、抗炎、止咳、祛痰，临床症状明显减轻，等待出院的患者。正常对照组：我院内科健康体检者10名(C组)。所有受试均知情并签署知情同意书。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集 所有受试者入院时、治疗后及内科健康体检者均采肘静脉血14 ml，其中4 ml离心后迅速分离血清，样品置-20℃冰箱中保存备检。治疗前后进行常规血气分析和肺功能检查。

　　1.2.2 细胞因子的测定 采用ELISA法检测血清中IL6、IL8、TNFα浓度，所用仪器为美国DPC公司Immulite免疫化学发光分析仪，试剂购自该公司。

　　1.2.3 分离中性粒细胞 所有受试者入院时、治疗后及内科健康体检者采肘静脉血14 ml，其中10 ml加3.8%枸橼酸钠3 ml抗凝，分4个试管加入分离剂3 ml，置于冰中。用密度梯度离心法分离获得中性白细胞，1 800 r/min离心40 min，除去最上层的血浆层和最下层的红细胞层，用KRP(KrebsRingrPhosphate)缓冲液(pH7.4)冲洗细胞三次，1 500 r/min离心30 min两次，沉淀物悬浮于200 μl KRP缓冲液中，置于冰中待测。

　　1.2.4 细胞色素C还原法测中性粒细胞(O2)释放量 双波分光光度仪在波长为550～540 nm的条件下，在反应试管中加不含Ca2+的KRP缓冲液1 ml，5%细胞色素C 10 μl，上述分离的中性粒细胞20 μL，37℃下预热8 min，分别计算受试者入院时、治疗后及内科健康体检者外周血中性粒细胞释放O2量。用超氧化物歧化酶(SOD)作为对照。每人测5次，取平均值。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS11.0统计学软件进行统计分析，实验数据用x±s表示，统计分析用t检验。COPD患者外周血中性粒细胞释放的O2水平与肺功能、血气及细胞因子之间的相关性用Spearman等级相关性分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组血浆IL6、IL8、TNFα浓度比较 见表1。A组IL6、IL8、TNFα水平显著高于B组及C组(P<0.01)。B组IL8显著高于C组(P<0.01)。B组IL6、TNFα与C组无明显相关性(P>0.05)。

　　2.2 外周血中性粒细胞释放O2量及肺功能和动脉血气变化 A组及B组患者外周血中性粒细胞释放O2量显著高于C组(P<0.01)。A组外周血中性粒细胞释放超O2显著高于B组(P<0.01)，肺功能和血气变化的趋势同O2，见表2。表1 各组患者IL6、IL8、TNFα的变化(x±s，ng/L)表2 各组患者O2，肺功能和动脉血气的变化

　　2.3 外周血中性粒细胞释放O2水平与肺功能及血气间的关系 A组患者外周血中性粒细胞释放超O2水平与其第1秒用力呼气容积(FEV1)、FEV1占预计值百分比、FEV1/用力肺活量(FVC)、 PaO2呈明显负相关(r分别为-0.539，-0.531，-0.542，-0.652，P均<0.01)。与PaCO2无明显相关性(P>0.05)。

　　2.4 外周血中性粒细胞释放O2与细胞因子相关性分析 A组患者外周血中性粒细胞释放超O2水平与血浆IL6、IL8、TNFα浓度呈线性正相关(r分别为0.895，0.876，0.892，P均<0.01)。B组患者外周血中性粒细胞释放超O2水平与IL8浓度呈直线正相关(r为 0.675，P<0.01)。B组患者外周血中性粒细胞释放超O2水平与血浆IL6、TNFα浓度无明显相关性(r分别为0.192，0.186，P均>0.05)。

　　3 讨 论

　　COPD发病机制复杂，其中细胞因子及氧化抗氧化失衡在其发病中的作用随着分子生物学及其他相关科学的发展越来越受到重视。氧化抗氧化失衡可导致蛋白酶失活、气道上皮损伤、黏液分泌过多、增加中性粒细胞在肺微血管系统的聚集及前炎症介质的基因表达〔4〕。本实验结果提示COPD加重期患者外周血中性粒细胞释放O2量明显增加且与COPD病情的进展存在一定关系。

　　研究发现〔5〕，在阻力呼吸情况下血浆中IL6明显升高，加用抗氧化剂可以阻断阻力呼吸导致的IL6水平下降。TNFα是通过刺激NFκB DNA的结合活性诱导COPD患者气道平滑肌细胞IL6释放〔6〕。体外试验表明，IL8与中性粒细胞表面特异性受体结合，导致细胞变形反应、脱颗粒反应、呼吸爆发反应、释放溶酶体、形成超氧化物，从而促进炎症反应〔7〕。NADPH氧化酶是产生氧自由基的关键酶。本研究结果提示IL6、IL8、TNFα细胞因子可能通过激活NADPH氧化酶释放超O2，从而导致肺组织损伤，促使肺气肿的逐渐发展，肺功能逐步恶化。

　　值得注意的是，本研究提示缓解期氧化应激仍持续存在。因此，COPD患者病情进展，不仅仅存在于急性加重期，在缓解期仍然存在。

　　COPD患者在病毒感染、细菌感染等诱因下病情恶化，加重期炎症细胞在细胞因子、趋化因子、黏附因子、烟雾等刺激下活化，释放氧化物质增多，可能导致COPD急性加重期时肺组织损伤加重，肺功能逐步恶化。因此，针对细胞因子的治疗将为我们提供更有效的选择。

参考文献

　1 Q′Donnell R，Breen D，Wilson S，et al.Inflammatory cells in the airways in COPD〔J〕.Thorax，2006;61(5):44854.

　　2 Quinc JK，Wedzicha JA.The neutrophil in chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2007;119(5):106571.

　　3 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2002;25(8)：45360.

　　4 Tsuwaki S，Yoshikawa K.Relationships of p40phox with p67phox in the activated and expression of the human respiratory burst NADPH oxidase〔J〕. J Biochem，2000;128(5):77783.

　　5 Theodoros V，Paraskevi K，MariaHelena K，et al.Strenuous resistive breathing induces plasma cytokines〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2002;166(12)：15728.

　　6 Alaina JA，Rebecca KH，Yassine A，et al.Tumor necrosis factor a induced secretion of RANTES and inteleukn6 from human airway smoothmuscle cell〔J〕.Am J Respor Cell Mol Biol，2000;23(6):794802.

　　7 Wymann MP. The onset of the respiratory burst in human neutrophils. Realtime studies of h30Z formation reveal a rapid agonist induced transduction process〔J〕.J Biol Chem，1987;262(25):1204853.