中国7市家蝇rDNAITS2基因浅析

作者：胡佳林 郑学礼 陈晓光

【摘要】 目的：分析我国7市家蝇的rDNAITS2基因. 方法：采集北京、吉林、长春、成都、南京、湖北荆州和养殖7市8个家蝇样本，形态鉴定. 依据Drosophila melanogaster的nrRNA序列，设计扩增不同地区家蝇rDNAITS2基因的引物，PCR扩增不同地区家蝇基因组，获特定基因片段，SSCP分析. 将PCR扩增不同地区家蝇rDNAITS2片段克隆于pMD18T载体，序列测定，采用Clustal W软件在线分析不同地区家蝇rDNAITS2序列，用MegAlign(4.0)软件的UPMGA方法构建系统发育树. 结果：我国7市8个家蝇样品的rDNAITS2基因均获约360 bp阳性扩增区带. SSCP分析8个家蝇样品的rDNAITS2的SSCP电泳DNA迁移率均有一定差异. Clustal W比对分析不同地区的8个家蝇rDNAITS2基因序列间存在一定差异. 同源性为75%，而其中部分地区家蝇样品rDNAITS2序列同源性高，家蝇（长春、吉林、养殖），三者之间的同源性为98.0%~99.1%；家蝇（成都、南京、广州、荆州）之间的同源性为99.1%~99.7%. 系统聚类分析显示，发育树共分成2支，1支是家蝇（北京与养殖）关系密切，先聚为一类，然后与家蝇（长春）再聚类；另1支是家蝇（成都与荆州）关系密切，最先聚类，然后与家蝇（南京）聚类，再与家蝇（广州）聚类，最后与家蝇（吉林）聚类. 结论：应用PCRSSCP和rDNAITS2基因序列分析揭示我国不同地区家蝇基因组序列存在一定差异.
【关键词】 家蝇；不同地区；SSCP；rDNAITS2；序列分析
　　0引言
　　家蝇（Musca domestica Linnaeus）属于双翅目(Diptera)蝇科（Muscidae）家蝇属（Musca Linnaeus）， 是常见的一种嗜尸性蝇类. 在法医检案中，准确鉴定嗜尸蝇种类及所属地理种群，为推断死亡间隔时间和地点提供依据［1］. 随着分子生物学技术的迅猛发展，为动物、植物等生物种类鉴定和系统发生提供了新方法. 根据18 S，5.8 S，28 S基因序列保守性，便于设计引物扩增ITS1和ITS2片段，是种下分类、近缘种鉴别、系统发育分析的理想分子标记. 我们分析了我国六省区家蝇ITS2序列变异，为探索家蝇种间及种内分子分类和系统发生提供佐证，对法医检案精确鉴定嗜尸性蝇种类及判断家蝇所属地理种群，进而推断案发地点和死亡间隔时间提供依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料家蝇样品采自我国2007年7市，记录采集样品时间、地点、地理位置. 广州、长春、吉林3个地区蝇类是采集于腐臭猪尸体和鱼肠做诱饵的诱笼捕获；其它城市与地区蝇类是采用网捕方法采集. 应用形态学特征进行种类的鉴定，然后将采集标本放入-20℃冰箱储存备用，用于DNA提取. 具体步骤见参考文献［2］ ，用TE溶解DNA，4℃储存备用.
　　1.2方法rDNAITS2基因扩增引物设计根据Drosophila melanogaster的nrRNA基因序列（Accession number:M21017）为模板，用Primer Premier 5.0软件设计引物：MDF1上游：5′TGC TTG GAC TAC ATA TGG TTG A3′；MDR1下游：5′GTA GTC CCA TAT GAG TTG AGG TT3′. PCR反应体系为25 μL，其组成：DNA模板10~100 ng，每一引物浓度约10 pmol/L， 每一dNTP 0.25 mmol/L， 1×反应缓冲液［200 mmol/L TrisHCl， 100 mmol/L KCl， 20 mmol/L MgCl2， 100 mmol/L (NH4SO4)］， 1 U Taq DNA聚合酶（大连宝生物工程有限公司），经过比较PCR的程序确定为： 94℃ 5 min(预变性)，94℃变性30 s， 53℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30个循环， 最后72℃延伸10 min. PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳后切下目的片段，用Omega公司Gel Extraction Kit试剂盒回收，纯化后的片段与PMD18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，16℃条件下反应12 h后转化大肠杆菌DH5a菌株，转化后的菌株在Amp+的LB培养基上选择培养，挑选阳性克隆摇菌培养，提取转化质粒，使用PCR方法分析插入片段的大小，鉴定是否有目的片段. 目的片段测序工作由Invirtrogen生物科技公司完成. 对PCR扩增产物进行SSCP银染检测， 取扩增产物10 mL加等量上样Buffer(甲酰胺∶1 g/L溴酚蓝∶300 mL/L甘油=5∶2∶3），沸水浴10 min， 立即冰浴5 min， 50 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，150 V电压预电泳30 min， 然后在4℃ 80 V条件下电泳2.5~3.0 h. 凝胶染色：100 mL/L乙醇5 min，10 mL/L硝酸5 min，三蒸水洗涤凝胶3次，每次5 min，5 g/L硝酸银避光染色30 min，显色（30 g/L无水碳酸钠，每100 mL显色液加70 mL甲醛溶液），100 mL/L乙酸终止. 单链DNA (ssDNA)的迁移率(mobliity， M)以DNA Markers的最小片段移动的所在位置作为参照点的迁移距离， 按下式计算出ssDNA的相对M值：M=DNA样品从点至迁移点的距离（mm）/从原点至参照点的距离（mm）. 用Clustal W在线查询进行序列比对分析. 用MegAlign（4.0）软件的UPMGA方法构建系统发育树，系统树中节点的自举检验值（Bootsrap confidence level， BCL）采用Bootstrap法检验，共500次循环.
　　2结果
　　2.1家蝇rDNAITS2基因扩增和银染用MDF1和MDR1引物，不同地区家蝇基因组DNA为摸板，PCR扩增8个不同地区家蝇的rDNAITS2基因，结果均扩增出预期大约360 bp的阳性扩增区带. 不同地区家蝇rDNAITS2的约360 bp片段经SSCP分析显示，8个不同地区家蝇rDNAITS2的SSCP电泳DNA迁移率均有一定差异. M. domestica(北京)，M. domestica（吉林）， M. domestica(长春)，M. domestica(成都)，M. domestica(南京)，M. domestica(广州)，M. domestica(荆州)和M. domestica(养殖)样本第一条单链DNA迁移率（M1）分别为0.1692，0.1692，0.1692，0.2154，0.1692，0.1538，0.2，0.2；其第二条单链DNA迁移率（M2）分别为0.5230，0.5345，0.5345， 0.5077，0.5345，0.4769，0.5692，0.5538（图1）. 进一步分析可见：北京、吉林、长春、南京样本M1完全相同，荆州和养殖样本的M1相同，成都样本M1值与荆州和养殖的接近，广州样本的M1大小与上述地区有一定差异；吉林、长春和南京样本M2值完全相同，荆州和养殖样本M2值接近，成都和广州的M2值与上述地区有一定差异(图1). 转贴于 1：北京； 2：吉林； 3：长春；4：成都；5：南京； 6：广州； 7：荆州； 8：养殖；M：100 bp DNA marker.
　　图1PCRSSCP分析不同地区家蝇rDNAITS2的PCR扩增片段
　　2.2家蝇rDNAITS2基因序列8个家蝇样本rDNAITS2同源性为75.0％，而其中部分地区家蝇样本rDNAITS2序列同源性很高，一组是采集自北京、长春、养殖的家蝇样本，同源性为98.0%~99.1%， 分歧率0.9%~2.0％；另一组是采集吉林、成都、南京、广州、荆州的家蝇样本，同源性为99.1%~99.7%，分歧率0.3%~0.9％（表1）. 不同地区家蝇rDNAITS2序列碱基组成了不同特征（表2）.表1不同地区家rDNAITS2片段进化分歧表2不同地区家蝇rDNAITS2序列特征
　　2.3构建系统发育树据不同地区家蝇 rDNAITS2序列，采用MegAlign(4.0) UPMGA树（图2）. 发育树共分成2支，1支是家蝇的北京与养殖样本关系密切，先聚在一起，然后与长春家蝇再聚；另1支是成都与荆州样本关系密切，最先聚类，然后与南京样本聚类，再与广州样本聚类，最后与吉林聚类.
　　3讨论
　　运用细菌通用保守基因23SrDNA作为靶基因，选取特异区段作鉴定片段，对食源性感染致病菌进行PCR扩增检测，PCRSSCP技术可将这些菌株鉴定到属和种的水平［3］. 目前尚未见应用PCRSSCP技术进行家蝇不同地理株分析的报道. 我们应用PCRSSCP银染技术分析我国7市的家蝇rDNAITS2基因，显示8个不同地区家蝇rDNAITS2的SSCP电泳DNA迁移率均有一定差异. M.domestica(北京)，M.domestica（吉林），M.domestica（长春）三者的DNA迁移率相比，其ssDNA迁移率较为接近；M.domestica （成都），M.domestica（南京），M.domestica（湖北荆州），M.domestica（养殖）四者的DNA迁移率相比，其ssDNA迁移率亦较为接近；前三者与后四者的DNA迁移率相比，其ssDNA迁移率差异较大；M.domestica（广州）与其他7个M.domestica样本相比，其ssDNA迁移率差异大. 采用Clustal W软件对我国不同地区家蝇rDNAITS2基因序列进行类似性分析比较，不同地区家蝇rDNAITS2基因序列同源性为75.0%， 不同家蝇种群间存在丰富遗传多态性，表现了种内基因序列的差异，养殖品系与长春、北京的样本分歧率低，为0.9%~2.0%，与吉林、成都、南京、广州和荆州样本分歧率较高，为90.8%~93.2%. 依据不同地区家蝇的rDNAITS2序列构建的系统发育分析显示，发育树共分成2支，1支是家蝇的北京与养殖样本关系密切，先聚在一起，然后与长春家蝇再聚；另1支是成都与荆州样本关系密切，最先聚类，然后与南京样本聚类，再与广州样本聚类，最后与吉林聚类. 上述结果与我们应用ISSR分子标记鉴定我国不同地区的嗜尸蝇类的结果相近［4］. 这个研究结果对法医检案地点和昆虫地理种群遗传研究，提供了科学实验资料. 本研究结果显示，我国不同地区的家蝇基因组序列存在一定的差异，聚类分析结果荆州、广州、南京、成都与养殖样本的分歧率表现为随纬度升高而增大趋势. 随着地球气候变化、人群流动、交通运输等活动，使一些昆虫种群遗传地理隔离也发生变化.
　　我们首次对我国7市家蝇rDNAITS2基因进行了克隆测序及差异性分析，研究结果表明rDNAITS2基因差异分析可以作为家蝇种内鉴定及近缘关系分析的一种分子标记，也可判断家蝇所属地理种群，为法医检案时推断死亡间隔时间和犯罪现场提供第一手资料.
【参考文献】
［1］ 蔡继峰，兰玲梅，陈瑶清，等. 丝光绿蝇COII序列分析与地理种群分布关系［J］. 法医学杂志，2006，22（6）：401-403.

［2］ An RS， Tan SJ， Chen XF. Improvement in grinding tissue extracting DNA from small insects ［J］. Entomol Know， 2002，39(4)：311-312.

［3］ 洪帮兴，江丽芳，胡玉山，等. 常见食源性感染致病菌属、种PCRRFLP及PCRSSCP技术鉴定探讨［J］. 中山大学学报，2005，26（2）：151-155.

［4］ 李铁华. 我国五省美洲钩虫COI基因序列多态性分析［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2003，21（4）：210-213.转贴于