关于AGE及葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA表达的影响

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　　　　　　　　　　 作者：王燕 邓正照 郭艳红 于海奕 高炜

【摘要】 目的： 探讨晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products， AGE)及葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA表达的影响. 方法： ①选择合适的培养时间；②不同浓度的AGE与THP1巨噬细胞共同孵育；③不同浓度葡萄糖与THP1巨噬细胞共同孵育；分别用AGE、葡萄糖及同时加入AGE和葡萄糖与THP1巨噬细胞孵育；⑤采用RTPCR检测孵育后CXCL16及CD36mRNA的表达量，观察和比较各组孵育后CXCL16及CD36 mRNA的表达情况. 结果： ①随着培养液中AGE浓度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表达增加；②随培养液中葡萄糖浓度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表达增加；③AGE及葡萄糖同时作用于THP1巨噬细胞时，对CXCL16及CD36 mRNA的表达上调作用大于AGE或葡萄糖单一因素的影响. 结论： AGE及葡萄糖呈时间和浓度依赖性上调THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA的表达，并且AGE及葡萄糖两者合用可以进一步增加这种表达. 这可能为糖尿病动脉粥样硬化机制的探讨提供新的线索.
【关键词】 CXCL16；糖基化终产物，高级；葡萄糖；糖尿病
　　0引言
　　结合磷脂酰丝氨酸和氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein， oxLDL）的清道夫受体（scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized lipoprotein， SRPSOX)是一种新发现的清道夫受体， 克隆分析证实其在分子结构上与趋化因子CXCL16是同一分子［1］. 作为清道夫受体，CXCL16可以介导巨噬细胞吞噬oxLDL，形成泡沫细胞，促进动脉粥样硬化的发生. 作为趋化因子，它可以参与炎症细胞的趋化及炎症细胞间的相互作用［2］. CXCL16的这种双重作用增强了炎症与动脉粥样硬化间的直接联系，也预示其在动脉粥样硬化性疾病中的重要作用. 多种炎性刺激因子如脂多糖、白介素18、干扰素γ及肿瘤坏死因子α等可使巨噬细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞的CXCL16表达增加 ［3］，同时也有报道AGE及高葡萄糖对其他清道夫受体如CD36的表达有上调作用［4-5］，但AGE或高葡萄糖是否影响CXCL16的表达国内外少见报道. 我们通过研究AGE及高葡萄糖对巨噬细胞表达CXCL16的影响，同时对AGE及高葡萄糖上调巨噬细胞表达CD36的作用加以验证，为糖尿病动脉粥样硬化并发症的发病机制的探讨提供新的线索.
　　1材料和方法
　　1.1材料佛波酯（PMA）、AGE购自美国Sigma 公司；葡萄糖购自北京泛基诺科技有限公司；TRIzol及其它RNA提取试剂为Gibco公司产品；所有引物由上海生工公司合成；cDNA 合成酶（MMLV）及Taq酶购自北京天为时代公司；其他试剂均为进口或国产分析纯.
　　1.2方法
　　1.2.1THP1细胞株培养人单核细胞系THP1株购于中科院上海细胞生物所细胞中心. THP1细胞生长于含有低糖（5.6 mmol/L），100 mL/L 胎牛血清，10 mmol/L HEPES，1×105 U /L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640 完全培养基中，置于37℃，50 mL/L CO2 饱和湿度培养箱内培养.
　　1.2.2实验分组取对数生长期THP1细胞（1×106个/皿）进行实验，每次实验前用100 nmol/L PMA孵育THP1细胞48 h，使其诱导分化为巨噬细胞［6］. ①单独AGE处理组：首先确定合适的培养时间，即用100 mg/L AGE与THP1巨噬细胞孵育不同时间（0，6，12，24，48，72 h），根据培养结果，选择72 h为合适孵育时间，不同浓度的AGE（ 0，50，100，150 mg/L）与THP1巨噬细胞共同孵育72 h；②单独葡萄糖处理组：用高浓度葡萄糖培养液（30 mmol/L）与THP1巨噬细胞孵育不同时间（ 0，6，12，24，48，72，96 h），确定72 h为合适培养时间后，用不同浓度葡萄糖（5.6，10，20，30 mmol/L）与THP1巨噬细胞共同孵育72 h；③AGE和葡萄糖联合作用组：分别用AGE(100 mg/L)、高浓度葡萄糖（20 mmol/L）及同时加入AGE(100 mg/L)和葡萄糖（20 mmol/L）与THP 1巨噬细胞孵育72 h.
　　1.2.3逆转录 聚合酶链反应检测CXCL16及CD36 mRNA的表达TRIzol试剂提取细胞总RNA，cDNA反应总体系为20 μL：10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.1 mol/L DTT 1 μL，500 mg/L Random primer 0.25 μL，6.7×108 nkat/L RNasin 0.5 μL， 3.3×107 nkat/L MMLV 1 μL，5×缓冲液2.0 μL. 以cDNA为模板，分别使用下述3对引物进行PCR，扩增CXCL16基因的引物序列为：上游5′ACTCAGCCAGGCAATGGCAAC 3′，下游5′GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC 3′，扩增片段长度为693 bp. 扩增CD36基因的引物序列为：上游5′CTCCCAAAGTGCTGGGATTA 3′，下游5′AGCCTTTGGGGGTCTTTCTA 3′，扩增片段长度为246 bp. 扩增内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的引物序列为：上游5′CTGGTCACCAGGGCTGCTTTT 3′，下游5′CATGAGGTCCACCACCCTGTT3′，扩增片段长度为936 bp. PCR反应条件为：95℃ 5 min 预变性，95℃ 30 s 变性，60℃ 30 s 退火，72℃ 30 s延伸，30 个循环，72℃ 继续延伸10 min. PCR反应总体系为20 μL： 无RNA酶水14.75 μL，10×缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL， 100 g/L引物各1μL，8.3×107 nkat/L Taq酶0.25 μL，cDNA模板1 μL.
　　1.2.4RT  PCR产物检测及半定量分析反应结束后，取5 μL PCR产物用10 g/L的琼脂糖凝胶恒压80 V电泳30 min， 溴化乙锭染色. 利用紫外投射分析仪对电泳结果进行观察并拍照. 运用软件SynGene Tools Analysis Software对PCR电泳结果进行灰度值扫描并半定量分析. 每例样品的CXCL16和CD36基因PCR产物的灰度值分别除以它们相应的内参GADPH基因PCR产物的灰度值， 从而得到上述两种受体基因mRNA的相对表达水平.
　　统计学处理：由SPSS13.0 统计软件完成，组内比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用StudentNewmanKeuls (q) 检验，P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1AGE作用于THP1巨噬细胞不同时间对CXCL16，CD36mRNA表达的影响THP1巨噬细胞与100 mg/L AGE孵育不同时间（ 0，6， 12，24，48，72 h），RTPCR 检测THP1巨噬细胞CXCL16及CD36 mRNA的表达. 随着孵育时间的延长，THP1巨噬细胞中CXCL16及CD36 mRNA的表达上调，孵育72 h CXCL16及CD36 mRNA表达与孵育0 h相比上调最明显（P&<0.01，图1）.
　　图1AGE作用于THP1巨噬细胞不同时间对CXCL16，CD36 mRNA表达的影响(n=4)
　　2.2不同浓度AGE对THP1巨噬细胞中CXCL16，CD36 mRNA表达的影响THP1巨噬细胞与不同浓度AGE（ 0，50，100，150 mg/L）孵育72 h后，RT PCR检测THP1巨噬细胞中CXCL16及CD36 mRNA的表达. 各浓度组CXCL16 mRNA的表达除在50 mg/L组与未加刺激因素的对照组（0 mg/L组）之间差异无统计学意义（P&> 0.05）之外，其他各组之间的差异均具有统计学意义(P&<0.05或0.01)； CD36 mRNA的表达在各浓度组之间差异均具有显著性(P&<0.05或0.01). AGE可使THP1巨噬细胞CXCL16及CD36 mRNA的表达上调，且呈剂量依赖关系（图 2）.
　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs 对照组；cP&<0.05 vs 50，150 mg/L(n=4).
　　图2不同浓度AGE对THP 1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA表达的影响
　　2.3葡萄糖作用于THP1巨噬细胞不同时间对CXCL16，CD36mRNA表达的影响THP1巨噬细胞用30 mmol/L的高浓度葡萄糖培养液孵育不同时间（0，6，12，24，48，72，96 h），RTPCR检测THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达. 随培养时间的延长，THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达上调，与孵育0 h相比，孵育72 h时THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达上调最明显（P&<0.01，图3）.
　　2.4不同葡萄糖浓度对THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA表达的影响THP 1巨噬细胞与不同葡萄糖浓度（5.6，10，20，30 mmol/L）培养液孵育72 h后，RT PCR检测THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达. CXCL16 mRNA的表达除在20 mmol/L组与30 mmol/L组之间的差异无显著性（P&>0.05）之外，其他各组之间的差异均具有显著性(P&<0.05或0.01)；CD36 mRNA的表达各组之间差异均具有显著性(P&<0.05或0.01). 培养液中随葡萄糖浓度的升高，THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达逐渐增加，呈剂量依赖关系（图 4）.
　　图3葡萄糖作用于THP 1巨噬细胞不同时间对CXCL16，CD36 mRNA表达的影响(n=4)
　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs 5.6 mmol/L组；cP&<0.05 vs 10 mmol/L组，eP&<0.05 vs 30 mmol/L组（n=4）.
　　图4不同葡萄糖浓度对THP 1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA表达的影响
　　2.5AGE和葡萄糖同时作用于THP1巨噬细胞对CXCL16，CD36mRNA 表达的影响THP1巨噬细胞分别与葡萄糖（20 mmol/L）、AGE(100 mg/L)、同时加入葡萄糖（20 mmol/L）和AGE(100 mg/L)孵育72 h，RTPCR检测THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达. 高葡萄糖和AGE分别作用于THP1巨噬细胞时均可使CXCL16，CD36 mRNA表达上调. 二者同时作用时THP 1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA表达上调的程度大于单一因素的作用（P&<0.05，图5）.

3讨论
　　CXCL16是一种新发现的清道夫受体，表达在巨噬细胞、血管平滑肌细胞和血管内皮细胞上. 它是继CX3CL1之后发现的第二个既能以膜结合形式存在又能以分泌型的可溶性分子存在的趋化因子. 以膜结合的形式存在时，CXCL16发挥清道夫受体的功能，结合并吞噬磷脂酰丝氨酸包被的颗粒如凋亡小体和oxLDL ［7］. 在金属蛋白酶10(metalloproteinase 10)的水解作用下CXCL16的细胞膜外部分脱离细胞膜表面成为游离的分子，发挥趋化因子的功能［8-9］.
　　我们的实验结果表明AGE和高葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA的表达有上调作用，且二者共同作用可使CXCL16 mRNA表达进一步增加. 是否影响蛋白的表达（包括膜结合形式和分泌形式）还需要进一步的研究. 我们同时观察了AGE和高葡萄糖对CD36 mRNA的表达，结果与文献报道的结果基本是一致的，能够上调CD36 mRNA的表达［4-5］. 已有研究证明巨噬细胞CXCL16表达的增加促进了对oxLDL的吞噬和泡沫细胞的形成，组化分析也表明CXCL16主要表达在动脉粥样硬化的斑块处，而无动脉粥样硬化斑块的血管未见有表达［10］. 由此可见AGE和高葡萄糖能够刺激巨噬细胞CXCL16表达的增加，对解释糖尿病患者过高的动脉粥样硬化疾病危险性有重要意义.
　　AGE及高葡萄糖促进CXCL16mRNA表达的机制尚不清楚. AGE可以上调多个清道夫受体的表达，包括清道夫受体A、清道夫受体B1，CD36和血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（ lectinlike oxidized lowdensity lipoprotein receptor1，LOX1，对不同受体AGE调控机制不同. 就CD36来说，AGE与其特异性受体（晚期糖基化终末产物受体）结合，通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ而促进CD36的表达［4］. 高葡萄糖对CD36表达的上调作用可能是通过影响巨噬细胞内的氧化应激张力，增加脂质过氧化实现的［5］. 高葡萄糖也可以上调LOX1的表达，可能的机制是高葡萄糖增加细胞内活性氧基，启动蛋白激酶C/促分裂原活化蛋白激酶通路，最后通过激活核因子κB和活化蛋白1上调 LOX1的表达［11］. 本研究发现AGE和高葡萄糖同时刺激THP1巨噬细胞时，使CXCL16，CD36mRNA表达上调的程度大于两种因素单独作用也提示AGE和高葡萄糖可能是通过不同的作用机制上调THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达.

参考文献

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