关于甲基化特异性PCR技术的质量控制及改进

作者：顾立萍 刘斌， 邢传平 黄小玲， 高自芳 苏勤军 钱震 董亮

【摘要】 目的： 改进甲基化特异性PCR(MSP)技术并控制实验质量. 方法: 采用改进的MSP法检测正常胃粘膜及胃癌组织中caveolin1基因的甲基化状况.运用饱和酚氯仿抽提法提取DNA，其中石蜡包埋组织连续切片厚度为8μm；采用热启动PCR：反应体系为25 μL、变性温度设定为95.5℃、循环数设定为30. 结果： 新鲜组织较石蜡包埋组织更适于MSP实验，但福尔马林固定石蜡包埋组织同样可用于MSP实验，并且8μm厚的石蜡包埋组织能获得较完整的DNA链. 热启动PCR效果良好：25μL体系敏感性优于50μL体系，95.5℃可以使含CpG岛的DNA链解链更完全，30个循环足以扩增小于150 bp的目的片段. 结论： 采用改进的MSP技术，可获得较好的DNA模板，提高实验的灵敏度和成功率，更适于甲基化的研究.
【关键词】 甲基化；聚后酶链反应；DNA/分离和提纯；胃肿瘤
　　0引言
　　肿瘤的发生具有多阶段、多基因的特征，是多基因遗传学和表遗传学共同起作用的结果［1］. 在表遗传学机制中，DNA甲基化研究最多，也是最深入的一种机制. 目前，针对DNA甲基化的研究方法中，甲基化特异性PCR（methylationspecific PCR， MSP）技术是最基础和最可靠的方法. 现行的实验多采用新鲜组织作为标本来源，但医院病理科保存的大量石蜡包埋组织，是分子生物学研究材料的可靠来源，也是进行回顾性研究的宝贵资源. 本研究从石蜡包埋组织及新鲜组织中提取DNA，运用MSP技术对胃癌组织及正常胃粘膜中的caveolin1基因第一外显子CpG岛的DNA甲基化状况进行了检测，并对部分实验步骤进行了调整和改进，取得了较好的效果.
　　1材料和方法
　　1.1材料7例正常胃粘膜和37例胃癌组织（6例福尔马林固定石蜡包埋组织、31例新鲜组织）均来自兰州军区总医院病理科200612/200708手术及存档石蜡包埋标本. 患者术前均未经辅助放、化疗. MSP试剂盒购于美国CHEMICON公司. caveolin1基因甲基化和非甲基化引物由大连宝生物工程有限公司合成，PCR相关试剂亦购自大连宝生物工程有限公司.
　　1.2方法
　　1.2.1新鲜组织及福尔马林固定石蜡包埋组织中DNA的提取采用传统的饱和酚氯仿抽提法提取DNA［2］，通过紫外分光光度仪检测DNA含量，选取A260 nm/A280 nm值在1.8～2.0的标本，并对DNA的完整性进行检测，选取理想标本进行实验. 提取组织冻存于-40℃. 实验主要操作步骤简述如下：石蜡包埋组织切片厚度8 μm，连续切片8张，经二甲苯（2次）脱蜡，过无水乙醇（2次）；加入DNA消化缓冲液500 μL(0.1 mol/L EDTA， 10 mmol/L Tris，10 g/L SDS，调pH 8.0)，再加入20 g/L蛋白酶K7 μL并过夜（37℃，24 h）；用酚氯仿（1∶1）法抽提(2～3次)，沉淀于70 μL三蒸水中（已消毒）. 新鲜组织称取40 mg，匀浆器研磨后其余步骤同石蜡包埋组织.
　　1.2.2DNA甲基化修饰(亚硫酸氢钠修饰)甲基化修饰严格按照试剂盒说明书进行，步骤简述如下：①DNA修饰：每个样本取1 μg DNA溶于100 μL三蒸水中，加入7 μL 3 mol/L NaOH变性处理10 min(50℃水浴)，加入550 μL试剂Ⅰ（pH 5.0)水浴16 h(50℃，避光)；②脱盐处理：加入5 μL试剂Ⅲ（pH 5.0）并混匀，加入750 μL试剂Ⅱ37℃水浴10 min，加入1 mL 700 mL/L乙醇，6000 g离心20 s，弃上清，共做3次，高速离心2 min，吸去剩余悬浮液；③完全甲基化（脱磺酸基作用）、二次脱盐、DNA纯化：加入50 μL 20 mmol/900 mL/L乙醇溶液到标本中，短暂摇匀，37℃水浴5 min，6000 g离心20 s，加入1 mL 900 mL/L乙醇振荡，再次离心，重复本步骤1次，高速离心2 min，吸去剩余悬浮液，室温放置10 min，加入TE（pH 7.5）缓冲液25 μL并混匀，60℃孵育样本15 min，高速离心4 min，移出混悬液（样品DNA）到新试管，置于-40℃.
　　1.2.3MSP根据GenBank中caveolin1基因外显子1的基因序列(AF095591)，采用Prime 5.0软件，针对外显子1的启动子CpG岛区域设计并合成引物. 甲基化引物：Sense，5′gggttcaaagcgggaaaatg3′； Antisense，5′ taggcactccccaaggttct 3′；非甲基化引物：Sense，5′ gggtttaaagtgggaaaatg 3′； Antisense，5′ taaacactccccaaaattct 3′，产物大小均为139bp. 由于修饰试剂昂贵，故从所提标本中选取最理想的DNA样本进行修饰，其中正常胃组织7例、胃癌标本37例. 每份经修饰后的标本均同时用甲基化和非甲基化引物进行扩增，均采用热启动PCR. PCR运用25 μL反应体系(表1). PCR产物用20 g/L的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，凝胶成像系统成像. 表1PCR反应体系
　　统计学处理：采用Fisher精确概率法，使用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，P&<0.05为有统计学意义.
　　2结果
　　2.1福尔马林固定石蜡包埋胃癌组织中获取的基因组DNA从福尔马林固定石蜡包埋胃癌组织中提取的基因组DNA，大部分已断裂，而且所提DNA的含量较新鲜组织浓度明显降低(图1).
　　1~2：DNA大部分断裂；3：提取DNA浓度最高且完整；4：实验失败病例；5~8：DNA完整. 5和6浓度高于7和8.
　　图1福尔马林固定石蜡包埋胃癌组织中提取的基因组DNA
　　2.2新鲜胃癌组织中获取的基因组DNA新鲜胃癌组织中DNA断裂现象较从福尔马林固定石蜡包埋组织明显减少，且DNA含量明显提高，经分光光度仪检测，所含蛋白，mRNA，酚等杂质明显减少（图2）.
　　2.3胃癌中caveolin1基因甲基化状态6例石蜡包埋癌组织中，有5例实验成功，成功率为83%. 31例新鲜胃癌标本中，有25例成功，成功率为81%. 7例正常胃标本均显示甲基化阴性而非甲基化阳性. 30例实验成功胃癌标本中，23例（77%）癌组织检测出caveolin1启动子区CpG岛异常甲基化，其中13例癌组织（43%）表现为完全甲基化；10例癌组织（30%）表现为部分甲基化. 癌组织caveolin1甲基化率显著高于正常组织（P&<0.01， 图3）.
　　3讨论
　　MSP技术的成功取决于完整且纯度较高的DNA模板、完全的亚硫酸氢钠修饰、准确且特异的引物、适合的PCR反应体系. 采用酚氯仿抽提法提取DNA，每份样本从DNA提取到最终MSP扩增产物用电泳仪检测，大概需要经过5 d时间，操作步骤繁多，影响因素甚多，所以MSP技术的难度很大，需严格操作，并适时调整实验条件. 但该方法灵敏度高、特异性强，仍是目前DNA甲基化研究方法中最基础和最可靠的方法［3-5］.
　　本实验室从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取基因组DNA时，严格操作，并对实验步骤进行了细节性调整，获得了较理想的模板DNA. 福尔马林固定后，标本DNA链的脆性增加， 受到剪切力时，更易发生随机断裂［6］; 且DNA与蛋白质之间经广泛交联后形成牢固的复合物， 阻碍蛋白酶对组织的消化，影响DNA提取［7］. 石蜡组织切片过厚不利于组织脱蜡和蛋白酶消化，过薄则易造成机械损伤， 同时切片总面积增加， 其表面粘附的PCR抑制因子将可能增多［8］， 我们选择厚度为8 μm. 用蛋白酶K进行消化时，适当地增加蛋白酶K浓度和消化时间，有利于组织消化和DNA 的释放. 蛋白酶K的工作温度选择37℃，有利于发挥其活性、并保护DNA的完整性. 所有DNA样本均进行完整性检测. 从石蜡包埋组织中提取的模板，虽含有少量杂质［9］，但只要选取理想的模板DNA进行修饰，还是可以取得良好的扩增效果. 但从基因组DNA的完整性、含量、纯度来讲，MSP技术应选用新鲜组织用于实验. 转贴于 MSP技术的成败关键在于引物的设计. 引物设计原理如下:标本DNA如未发生甲基化，在经过亚硫酸盐处理后， CpG岛中鸟嘌呤则变为尿嘌呤，即C→U;如发生甲基化，经过处理后， 鸟嘌呤不发生改变［10］. 本实验也曾采用国外学者Engelman等［11］的caveolin1基因引物序列，PCR产生非特异性扩增（两条杂带、一条引物二聚体），并且目的条带的产量也较其他非特异性扩增产物少. 随后，我们采用Prime5.0软件重新针对caveolin1基因外显子1之前的CpG岛区域设计引物序列，得到139 bp的目的条带，仍有非特异扩增，但扩增产物中以目的条带含量最多. 建议设计好引物后(一般引物大小为15~30 bp为宜)，必须在PUBMED基因库中进行比对，保证引物与基因特异结合，产生特异的扩增产物. 扩增产物大小最好在150 bp以上，以便于测序.
　　DNA双链中总是存在非甲基化的胞嘧啶，使得修饰后的DNA双链不再完全配对，容易形成二级结构，PCR 扩增时不易解链. 因而我们采用热启动法进行PCR扩增：预变性之前，不加入Taq酶，在预变性之后再加入酶（温度保持在95.5℃）. 并将常规的变性温度由94.0℃提高至95.5℃，既不会使Taq酶失活，又使DNA双链解链完全（Taq酶在92.5℃，95℃，97.5℃的半衰期分别为130，40，5～6 min）. 实验发现，对于扩增较小的DNA片段，设置30～40个循环，扩增产物的量并无明显差别，为节省操作时间，宜选取30个循环. 25μL体系敏感性优于50 μL体系，而且节省试剂.
　　由于亚硫酸氢钠修饰试剂昂贵，本实验仅对6例福尔马林固定包埋组织中的DNA进行了修饰，并取得了良好的实验效果，为今后运用石蜡包埋标本进行分子生物学研究打下了良好的基础. 有报道指出，从950 mL/L乙醇固定石蜡包埋组织中提取的DNA较从福尔马林固定标本的DNA完整且含量很高. 因本院外检标本基本都用福尔马林固定，遂未对950 mL/L乙醇固定标本进行实验.

参考文献

［1］ Baylin SB，Herman JG.DNA hypermethylation in tumorigenesis:epigetics joins genetics［J］. Trends Genet， 2000，16(4): 168-174.

［2］ 张维铭.现代分子生物学实验手册［M］. 北京:科学出版社，2003:80-86.

［3］ Kee SK， Lee JY，Kim MJ， et al. Hypermethylation of the Ras association domain family 1A(RASSF1A) gene in gallbladder cancer［J］. Mol Cell，2007， 24(3):364-371.

［4］ Herman JG， Baylin SB. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation ［J］. N Engl J Med，2003， 349:2042-2054.

［5］ Huang QX， Jin F， Huang HF. Methodology of DNA methylation ［J］. Section Genet Foreign Med Sci， 2004， 27: 354-358.

［6］ Shi SR， Cote RJ， Wu L， et al. DNA extraction from archival formalinfixed， paraffinembedded tissue sections based on the antigen retrieval principle : heating under the influence of pH［J］. J Histochem Cytochem，2002， 50 :1005-1011.

［7］ Gillespie JW， Bert CJ， Bichsel VE， et al. Evaluation of nonformalin tissue fixation for molecular profiling studies［J］.Am J Pathol，2002，160(2):449-457.

［8］ Legrand B， Mazancourt P， Durigon M， et al. DNA genotyping of unbuffered formalin fixed paraffin embedded tissues［J］. Forensic Sci Int，2002，125:205- 211.

［9］ Bielawski K， Zaczek A， Lisowska U， et al. The suitability of DNA extracted from formalinfixed， paraffinembedded tissues for double differential polymerase chain reaction analysis［J］. Int J Mol Med， 2001， 8:573-578.

［10］ Li LC. Rajvir Dahiya Methprimer: designing primers for methylation PCRs［J］. Bioinformatics， 2002， 18(11):1427.

［11］ Engelman JA， Zhang XL， Lisanti MP. Sequence and detailed organization of the human caveolin1 and 2 genes located near the D7S522 locus(7q31.1). Methylation of a CpG island in the 5 promoter region of the caveolin1 gene in human breast cancer cell lines ［J］. FEBS Lett， 1999， 448(2-3):221-230.转贴于