关于清热复方对热休克大鼠肝、肺组织热休克蛋白基因表达的调控作用

作者：王洪琦，邹素芬，李建国

【关键词】 热证／中药疗法
　　摘要：【目的】探讨清热复方对大鼠热休克蛋白70(HSP70)表达的调控作用。【方法】将70只大鼠随机分为热休克模型组、热休克加白虎汤组、热休克加黄连解毒汤组、内毒素模型组、内毒素加白虎汤组、内毒素加黄连解毒汤组和正常对照组7组，每组10只。采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对热休克模型组、内毒素模型组和正常对照组大鼠的肝、肺组织进行了HSP70 mRNA表达的检测，观察清热复方白虎汤和黄连解毒汤分别对两种模型大鼠肝、肺组织HSP70 mRNA表达的影响。【结果】热休克模型组、热休克加白虎汤组和热休克加黄连解毒汤组中HSP70 mRNA的表达高于正常对照组（Ｐ＜００５）；热休克加白虎汤组和热休克加黄连解毒汤组均高于热休克模型组（Ｐ＜００５）；内毒素模型组、内毒素加白虎汤组和内毒素加黄连解毒汤组之间的HSP70 mRNA表达以及与正常对照组相比均无显著性差异（Ｐ＞００５）。【结论】提示不同因素导致的热证状态下HSP70的基因表达不一致，清热复方可诱导热休克大鼠肝、肺组织中HSP70表达的增加，从而提高细胞的耐受力，避免细胞组织的损伤。
　　关键词：热证／中药疗法；白虎汤／药理学； 黄连解毒汤／药理学；　　 热休克蛋白70；疾病模型，动物
　　生物体在高温或其他因素刺激下会诱导基因开放而合成一组新的蛋白质―热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。许多研究证实整体动物的热处理可预防随后的心、脑、肺、视网膜等损伤，并认为全身热处理对这些器官的保护作用与HSPs的表达有关［１］。HSPs作为分子伴侣，在维持细胞的正常形态及功能中起着重要作用，参与其他蛋白质的折叠、转运、合成等过程，与细胞内的其他肽类蛋白质结合，参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，其在多种疾病过程中的重要作用已经被大量证据证实。本研究主要采用逆转录聚合酶链反应(ＲＴＰＣＲ）观察白虎汤和黄连解毒汤对热休克、内毒素两种大鼠热证模型的HSP70基因表达的调控，以探讨清热解毒中药对HSP70表达的影响。
　　1 材料与方法
　　11 研究对象　　　　
　　清洁级健康雄性SD大鼠70只，体重(200±10)g，由中山医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：2696001。
　　12 药物与试剂　　　　
　　药物：白虎汤(石膏30g、粳米9g、知母9g、甘草3g)，每剂水煎浓缩至50mL，相当于生药1g/mL；黄连解毒汤(黄连9g、黄芩6g、黄柏6g、栀子9g)，每剂水煎浓缩至30mL，相当于生药1g/mL，4℃保存备用。
　　主要试剂：总RNA提取试剂盒和逆转录PCR反应试剂盒(大连宝生物工程有限公司提供)；RTＰＣＲ引物(Canada，Stress Gen Corp，STM507);βaction引物(上海生工生物工程公司提供)；DL2000 DNA Marker(大连宝生物工程有限公司提供)。
　　13 主要仪器　　　　
　　ＴＧＬ16G型台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；DNA／RNA纯度检测仪(Gene Quant American Pharmacia Biotech Corp)；PE9600型PCR扩增仪(American Perkin Corp)；EDAS120电泳凝胶图象分析系统(American Kodak Corp)。
　　14　动物分组及处理　　　　
　　70只雄性SD大鼠随机分为热休克模型组、热休克加白虎汤组、热休克加黄连解毒汤组、内毒素模型组、内毒素加白虎汤组、内毒素加黄连解毒汤组、正常对照组7组，每组10只。
　　141 热休克组大鼠模型的制备与处理
　　将大鼠按不同组别分别用生理盐水、白虎汤、黄连解毒汤灌胃(100g/kg)，1h后进行第2次灌胃，再经1h将大鼠置恒温烤箱中进行热休克处理，参考Cruiie方法［2］，温度控制在约55℃，测量大鼠肛温达到42℃，维持10～15min，密切观察大鼠动态，大鼠出现烦躁、乱窜动、毛发竖立、爪底湿润后，断头处死，取肺、肝组织备用。
　　142 内毒素组大鼠模型的制备与处理　　　　
　　将大鼠按不同组别分别用生理盐水、白虎汤、黄连解毒汤灌胃(100g/kg)，1h后于尾静脉注射内毒素(15mg/kg)，1h后再重复灌胃，3h后观察大鼠出现烦躁、乱窜动后，断头处死，取肺、肝组织备用。
　　143 正常对照组　　　　
　　生理盐水灌胃，不经其他任何处理，断头处死，取其肝、肺组织备用。
　　15 实验方法　　　　
　　采用ＲＴＰＣＲ法检测各组大鼠肝、肺组织中HSP70 mRNA的表达。
βaction引物序列：Sense Primer 5′ ACCACAGTCCATGCCATCAC 3′；Antisense Primer 5′ TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′。
HSP70引物序列：Sense Primer 5′ CTCCAGCATCCGACAAGAAGC 3′；Antisense Primer 5′ ACGGTGTTGTGGGGGTTCAGG 3′。
　　βaction扩增片段长度为450个碱基对(base pair，bp)，HSP70扩增片段长度为234bp。
　　ＲＴＰＣＲ反应体系组成：MgCl２ 60μL，10×ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｂuffer 80μL，TaKaRa LA Taq05μL，HSP70上下游引物各1μL，βaction上下游引物各1μL，Rnase Free dh3O 615μL，总反应体积为80μL。PCR扩增反应条件为：前预变性94℃ 2min，1个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环；后延伸15min。取出反应液约10μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，将电泳结果置于EDAS120电泳凝胶图象分析系统内扫描并摄片。采用Gelbase电脑软件对HSP70 DNA与βaction DNA条带进行光密度扫描，计算HSP70 DNA和βaction DNA吸收峰面积之比，即Ｄ值，以此估计HSP70 mRNA的表达情况。 　　16 统计学处理　　　　
　　用SPSS100软件进行多组间两两比较。
　　2 结果
　　各组大鼠肝、肺组织中HSP70 mRNA转录水平的比较结果见表1。表1 各组大鼠肝、肺组织中HSP70 mRNA转录水平（略）
　　结果显示，热休克各组与内毒素各组大鼠的肝、肺组织中HSP70 mRNA表达不同，热休克各组HSP70 mRNA表达均比正常对照组高（均Ｐ＜００５），而内毒素各组的表达与正常对照组相比均无显著性差异（Ｐ＞００５）。说明热刺激(热休克)比致热源更容易刺激细胞组织合成热休克蛋白，从而增加对组织细胞的耐热性和保护作用。热休克加白虎汤组及热休克加黄连解毒汤组的HSP70 mRNA的表达高于热休克模型组（Ｐ＜００５）；热休克加黄连解毒汤组大鼠在肝、肺组织中HSP70的表达与热休克加白虎汤组相比有显著性差异（Ｐ＜００５）。表明白虎汤和黄连解毒汤均能诱导HSP70表达的增加，从而增强对肝、肺组织的保护作用。相比之下，白虎汤较黄连解毒汤在肝、肺组织中更能诱导HSP70的表达。内毒素模型各组HSP70的表达与对照组相比差异无显著性（Ｐ＞００５），内毒素模型各组之间HSP70的表达亦无显著性差异（Ｐ＞００５）。表明给大鼠静脉注射内毒素不能诱导HSP70表达的增加，中药清热复方亦不能诱导内毒素模型组中HSP70表达的增多，提示内毒素导致的炎性发热不能刺激组织细胞合成对细胞有保护作用的HSP70。
　　3 讨论
　　一切生物在受到高温、缺氧、感染、创伤及乙醇等因素的刺激时，会发生细胞应答反应，其共同特点是产生一组具有生物活性的蛋白――热休克蛋白。HSPs是一组高度保守的伴随细胞蛋白，可使细胞非特异性抗损伤能力增加，能对抗更为严重的应激损伤。HSPs与一些基本的细胞功能有关，如蛋白转运、折叠和装配，是存在于细胞内的一种主要“分子伴侣”，在维持组织细胞的自身稳定和环境适应性方面有重要作用，对细胞抗御外界损伤具有保护作用，在生理和应激条件下均能表达。据报道，热休克时细胞中许多编码正常功能蛋白质的基因关闭，使大部分蛋白质的合成受抑制，而热休克基因被开启，HSPs合成增加［3］。自20世纪70年代以来，按照分子量的大小HSPs有HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP等家族，其中HSP70是目前国内外研究较多的，也是最重要的一类热休克蛋白。
　　目前认为HSP70有多种功能，是一种非特异性保护蛋白，人体在高温及各种有害因素刺激下，HSP70合成明显增加，以提高机体耐热和抗病毒能力，其广泛的生理和病理作用已成为当今生命科学研究的热点［4］。王燕如等［5］采用Western印迹法发现热休克预处理使肺泡巨噬细胞(PAMs)中HSP70 mRNA表达增多，且获得抵抗Ｈ２Ｏ２损伤的能力；用放射菌酮和放射菌素D分别从蛋白合成及基因转录水平阻断热休克基因的表达，能取消热休克对Ｈ２Ｏ２所致PAMs损伤的保护作用。李国成等［6］发现其自制健脾益气方能诱导大鼠提高HSPs的表达，防止胃粘膜损伤，促进溃疡的愈合，认为HSPs可能介导胃粘膜防御。
　　本研究结果表明，不同因素导致的热证状态下HSP70的基因表达是不一致的，热休克反应更类似中医所说的“阳明气分热盛证”，其表达的增强是细胞保护作用的体现，而白虎汤诱导其表达的进一步增强，一方面从HSP70的角度阐明了白虎汤对“实热证”的治疗效应；另一方面更证实了中医辨证论治的正确性。
　　参考文献：
　　［1］Minowada G，Welch W J.Clinical implications of the stress response ［Ｊ］．J Clin Invest，1995，95:3.
　　［2］Currie R W，Tanguay R M，Kingma J G.Heatshock response and limitation of tissue necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit heart［Ｊ］．Circulation，1993，87:963.
　　［3］Rinaldo J E，Gorr Y M，Stuieter R，et al.Effect of endotoxininduced cell injury on HSP70KD heat shock protein in bovine lung endothelial cells［Ｊ］．Am J Respir Cell Mol Biol，1990，3:245.
　　［4］Linquise S，Craig E A.The heat shock proteins［Ｊ］．Annu Rev Genet，1998，22:631.
　　［5］王燕如，黄生宁，罗正曜，等．对大鼠油酸肺保护作用的机制研究［Ｊ］．湖南医科大学学报，1995(6)：513．
　　［6］李国成，陶秀良，罗树星．健脾益气中药对乙酸慢性胃溃汤大鼠热休克蛋白表达的影响［Ｊ］．中国西医结合">中西医结合脾胃杂志，1999，7(3)：133．