作者：陈文华，庄礼兴，丁晓虹
【关键词】 穴位埋药线
摘要：【目的】探讨穴位埋药线法抑制癫痫持续状态(SE)后大鼠海马神经元凋亡的基因水平机制。【方法】以腹腔注射青霉素诱导大鼠SE，采用免疫组织化学法检测SE后大鼠海马神经元凋亡相关基因cjun、bcl2的表达。【结果】青霉素致SE后24h，穴位埋药线组、苯妥英钠组和常规针刺组与模型组比较，cjun表达降低，bcl2表达升高，两者分别与细胞凋亡指数(AI)呈正、负相关，其中以穴位埋药线组与模型组差异最为显著。【结论】提示穴位埋药线疗法可能通过抑制cjun、促进bcl2蛋白表达，阻止SE后大鼠海马神经元凋亡的发生发展，从而起治疗癫痫的作用。
关键词：癫痫持续状态／穴位疗法；神经元；基因，cjun；基因，bcl2； 疾病模型，动物；大鼠
癫痫反复发作引起的神经细胞死亡有死亡和凋亡两种形式。细胞凋亡是涉及一系列基因的激活、表达以及调控的过程［1］。与癫痫发作后细胞凋亡密切相关的基因有即早基因cjun、癌基因bcl2等。本研究主要通过检测SE后大鼠海马神经元凋亡相关基因cjun、bcl2的表达，探讨穴位埋药线疗法抑制SE后大鼠海马神经元凋亡的基因水平机制。
1 材料与方法
11 主要试剂与器材
苯妥英钠片剂，100mg／片，批号：020432；青霉素针剂，40万U／支，批号：U0205002，均为华北制药厂生产。细胞凋亡原位末端标记(Tunel法)检测试剂盒，批号90161220；cjun一抗，批号：2870702；bcl2一抗，批号：01261130；链霉菌抗生物素蛋白―过氧化酶(SP)试剂盒，批号：030408；联苯二胺(DAB)显色试剂，批号：20973559，以上试剂均购自北京中山生物技术有限公司。常规针刺组根据实验大鼠体型以美容针代替成人用针灸针进行操作。
12 动物分组与造模
健康纯系雄性SD大鼠40只，体重160～180g，由广州中山大学北校区实验动物中心提供(粤检证字2002A075)，随机分成空白组、模型组、苯妥英钠组、常规针刺组、穴位埋药线组，每组8只。除空白组外，其他4组动物以青毒素400万U／kg腹腔注射，复制癫痫持续状态(SE)模型［2-3］；空白组腹腔注射与模型组同等剂量的1539mmol／L温生理盐水。
模型评价：以大鼠出现行为和皮质脑电图改变视为造模成功。
①行为改变：大鼠的癫痫发作按Racine法［4］分为5级：Ⅰ级为口角和面部抽动；Ⅱ级为Ⅰ级+点头；Ⅲ级为Ⅱ级+前肢阵挛；Ⅳ级为Ⅲ级+后腿站立；Ⅴ级为Ⅳ级+跌倒。以大鼠出现Ⅳ～Ⅴ级发作，且持续20min以上为合乎标准。
②皮质脑电图改变：大鼠皮质脑电图出现痫性放电。
13 治疗方法
苯妥英钠组在致痫时给药；常规针刺组在造模前5d和致痫时均予以治疗，每天1次；穴位埋药线组在造模前3d埋线。①穴位埋药线组：选取大鼠穴位方法参照《实验针灸学》，取大椎、心俞透膈俞(双)。用长约5cm的00号医用羊肠线浸泡于安定液(含量5g／L)24h后备用；操作方法：穴位处剪毛，用龙胆紫作出标记，皮肤常规消毒，在标记中用20g／L利多卡因皮内麻醉，镊取一段约05cm长的药线，放置在6号注射针头的前端，后接针芯(28号15寸长的毫针剪去针尖)，左手拇、食指绷紧或捏起进针部位皮肤，右手持针，刺入到所需深度后，边推针芯，边退针管，将药线埋植在穴位的皮下组织或肌层内，针孔处用消毒棉签按压片刻。②常规针刺组：选大椎、心俞透膈俞(双)，用美容针，留针30min，期间加以平补平泻手法，每天1次。③苯妥英钠组：致痫后即予腹腔注射025mg／kg苯妥英钠。
14 指标检测
所有动物均在模型组致痫24h后麻醉，经40g／L多聚甲醛心脏灌注固定，断头取脑，标本常规脱水、浸蜡、包埋后，冠状连续石蜡切片(片厚4μm，以镜下所见相同海马切面形态为统一切片深度标准)。
141 原位细胞凋亡检测法(AP法)
检测穴位埋药线对SE后大鼠海马神经元DNA片段化的影响：预加热切片至60℃，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇入水；室温下001mol／L(pH60)柠檬酸钠Triton X100孵育8min，PBS漂洗2次；加50μL标记混合物，41℃水浴箱孵育1h，PBS漂洗2次；加50μL转换液41℃水浴箱孵育30min，PBS漂洗3次；加50μL5溴4氯3吲哚磷酸二钠盐(BCIP)显色液显色10min，PBS漂洗3次；封片后观察结果；用已知阳性片作为阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照，细胞核中有紫或深蓝色颗粒者为阳性染色细胞。每张切片计数3个不同视野(400×)内的阳性细胞数，取平均数作为细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)。
142免疫组化法
检测穴位埋药线对SE后大鼠海马cjun、bcl2蛋白表达的影响：常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇入水，流水冲洗2min；001mol／L(pH60)柠檬酸盐缓冲液加热(95℃)抗原修复10min，自然冷却至室温，PBS漂洗3次；加入30g／L的h3O250μL阻断内源性过氧化物酶，室温下作用10min；流水冲洗2min，用免疫组化划圈笔(PAP pen)在组织周围划圈，PBS漂洗3次；滴加封闭用正常羊血清工作液(SP9000)50μL，室温孵育10min，倾去(勿洗)；滴加cjun(1∶100)／bcl2(1∶100)一抗50μL，微波炉一档湿盒内微波处理25min，放置至7min；换湿盒，重复上述处理，PBS洗3次；滴加生物素化二抗工作液(IgG／Bio)50μL，微波炉一档温盒内微波处理25min，放置至8min，PBS漂洗3次；滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液(SA／HRP)50μL，微波炉一档湿盒内微波处理25min，放置至8min，PBS漂洗3次；DAB显色3min，PBS洗3次；苏木素复染，二甲苯透明，封片后观察结果；用已知阳性片作为阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照，细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性染色细胞。根据染色程度及染色细胞百分率进行分析评定：基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色较深者为2分，着色最深者为3分；每张切片至少计数500个海马神经元细胞，计算平均每100个细胞内的阳性细胞数，以百分数表示染色细胞百分率；将每张切片染色程度与染色细胞百分率相乘，所得数值为阳性表达指数。
143 相关性分析
对穴位埋药线组、苯妥英钠组、常规针刺组及模型组的cjun、bcl2蛋白阳性表达指数分别与AI进行相关性分析。
144 数据处理
结果用(±s)表示，t检验，采用SPSS 110统计软件处理。
穴位埋药线疗法对SE后大鼠海马神经元凋亡及相关基因表达的影响结果见表1、图1、图2。对表1结果行相关分析后可知：穴位埋药线组、苯妥英钠组、常规针刺组及模型组的cjun蛋白阳性表达指数与AI均呈正相关(P＜001)；bcl2蛋白阳性表达指数与AI均呈负相关(P＜001)。表1 穴位埋药线疗法对SE后大鼠海马神经元凋亡及相关基因表达的影响（略）
3 讨论
从多种癫痫模型中观察到的神经细胞凋亡现象在光镜和电镜水平显示有细胞皱缩、细胞核浓缩、染色质凝集、核膜内陷及凋亡小体形成等凋亡细胞的病理形态学特征，DNA凝胶电泳显示典型的DNA片段，流式细胞仪及Tunel法直接显示DNA片段，并且与凋亡相关的基因bcl2家族、p53、cfos和cjun在癫痫后表达［5-8］。
近年来研究表明，即刻早期基因(immediate early genes，IEGs)cjun可能通过编码核蛋白产物作为第三信使，参与癫痫发作后的病理生理变化及神经元凋亡［9］。有学者发现SE后CA3和CA1等区出现神经元凋亡，而且在此之前可见有IEGs，尤其是cjun强而长时间表达［10］。本实验采用免疫组织化学方法检测大鼠海马神经元中cjun蛋白的表达，发现腹腔注射青霉素致SE后24h，大鼠海马CA3、CA1区见cjun强表达，经穴位埋药线、苯妥英钠与常规针刺治疗后，cjun的表达明显降低，且与细胞凋亡指数(AI)呈正相关。抑癌基因bcl2的主要作用是抑制细胞凋亡和延长细胞寿命。Hockenbery等［6］认为bcl2的表达可显著地抑制由生长因子缺乏或过氧化物及自由基增加所诱导的细胞凋亡。李氏等［11］发现以马桑内酯诱导大鼠癫痫持续状态，可引起bcl2小幅度增高，而且海马神经细胞中bcl2蛋白含量与发作后时间的长短呈线性关系，发作6h以内bcl2含量最高，以后逐渐下降。bcl2蛋白水平的这种变化可能也是神经细胞自我保护机制之一，从而防止或减少程序性细胞死亡(PCD)的发生。本实验采用免疫组织化学方法检测大鼠海马神经元中bcl2蛋白的表达，在腹腔注射青霉素致SE后24h水平略有下降，这与文献报道的情况相符；经穴位埋药线、苯妥英钠与常规针刺治疗后的bcl2蛋白表达明显升高，且与细胞凋亡指数(AI)呈负相关。以上结果提示穴位埋药线疗法、苯妥英钠及常规针刺疗法可能通过抑制cjun蛋白表达、促进bcl2蛋白表达的作用，阻止SE后大鼠海马神经元细胞凋亡的发生发展，从而产生治疗癫痫的效应，而以穴位埋药线疗法作用最显著。
针灸治疗癫痫疗效确切，疗法众多，其中穴位埋药线疗法是根据针灸疗法的原则选取穴位，将以安定液泡制过的羊肠线，埋入特定穴位中。穴位埋药线后，异体物质在人体内经过逐渐液化后吸收，对腧穴产生一种持久的非特异性刺激冲动，经脊髓后角上传丘脑及大脑皮层，在皮层产生一新的优势兴奋灶，对病灶产生良性诱导，使相应病灶神经元的放电被削弱乃至解除，从而达到控制癫痫发作的效果。另外，穴位埋药线初期对穴位产生机械性刺激，以后肠线液化吸收，产生化学性刺激，加上安定的缓慢释放，具有穴位刺激疗法、组织疗法和药物疗法的共同作用。其整个操作过程实际上包括了中医的穴位封闭、针刺、刺血、留针(埋线)、机体组织损伤等多种刺激反应，因而疗效较为满意。我们以往的研究证实：穴位埋药线能改善癫痫动物模型脑电图的振幅和频率［11］；提高癫痫患者脑脊液γ氨基丁酸(CSFGABA)及头发铜、锌的含量［12］，且疗效均优于针刺法。本实验结果提示穴位埋药线结合抗癫痫药治疗癫痫，能较及时和有效地制止癫痫发作，改善细胞亚病理水平，降低细胞凋亡的介导诱因，同时调节凋亡相关基因，调动多元机制以阻止神经细胞凋亡的发生发展，有助于减少癫痫发作次数，延长发作间歇期，提高患者生存质量，为临床治疗癫痫提供了一条新思路。
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