摘要：【目的】探讨中药复方脑还丹对Aβ诱导的海马神经元损害的保护作用。【方法】采用MTT法及NSE免疫组化方法观察脑还丹含药血清对经Aβ25-35处理的原代培养的新生大鼠海马神经元的影响。【结果】体外培养的新生大鼠海马神经元经Aβ25-35处理后，活细胞数减少，而脑还丹含药血清能够促进神经元的存活率以及促进神经元的生长发育，与对照组比较有显著性差异(Ｐ＜005)。【结论】脑还丹能够减轻Aβ对海马神经元的毒性作用。
关键词：阿尔茨海默病/中药疗法；淀粉挥β蛋白；神经元/药物作用，细胞，培养的
老年性痴呆，即阿尔彩默病(Alzheimer s Disease AD)，是引起痴呆最常见的进行性退行性神经病。临床表现以认知功能减退为主，病理学特征包括神经元丢失、神经元纤维缠结(NFT)、老年斑(SP)和淀粉样血管病变等。β-淀粉样蛋白(Aβ)是AD病人老年斑中的主要成分，许多研究表明Aβ与AD发病有关［１－４］。因此，保护神经元免受Aβ的神经毒性可能是防治AD的有效手段之一。笔者在具有抗老防衰作用的古方“草还丹”的基础上总结了自己长期的临床实践经验，以骨碎补、熟地、菖蒲等组方“脑还丹”，该方具有补肾填精、活血通络、涤痰开窍、平衡阴阳的功效，初步研究表明，“脑还丹”对老年性痴呆患者及痴呆动物具有一定的疗效［５－７］。我们通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、神经元特异性稀醇化酶(NSE)免疫组织化学方法以了解脑还丹对Aβ诱导神经元损害的保护作用，为脑还丹防治老年性痴呆进一步提供实验依据。
1材料与方法
11 试剂
DMEM/F12培养基、小牛血清均由Gibco公司提供；Aβ25～35、多聚赖氨酸、MTT均由Sigma公司提供；NSE免疫组化试剂盒、NSEⅠ抗均由博士德公司提供；二甲基甲矾(DMSO)Dhanks，胰蛋白酶，磷酸缓冲液(PBS)，40g/L多聚甲醛等。
12 仪器
倒置显微镜、超净工作台(江苏苏净BHC-1300ⅡA/B3型)；二氧化碳培养箱(德国Heraeus P63450 Hanau型)；培养板(美国Orange公司)；酶联免疫分析仪(Wellscan MK3型)；全自动图像处理系统(德国KONTRON IBAS20型)。
13 动物
新生SD大鼠(24h内)，SD大鼠，由中山大学北校区实验动物中心提供。
14 脑还丹大鼠含药血清的制备
脑还丹由中药骨碎补15g，熟地25g，菖蒲10g等组成，使用颗粒剂(江苏江阴制药厂提供，批号0208136)，按所含生药量配制成不同浓度的药液。取健康SD大鼠30只，220～250g，雄性，随机分为3组，分别按10g・kg１・d－１、5g・kg１・d－１剂量的药液把1mL・kg１・d－１生理盐水连续7d，末次灌药后1h腹主动脉取血，离心制备血清，分别标记为高剂量组，低剂量组及对照组，经过滤除菌后4℃贮存备用。
15 淀粉样蛋白的“老化”处理
将Aβ 25～35 1mg溶解在1mL DMEM/F12培养基内，置于37℃恒温箱内孵育4～7d，进行老化处理，然后4℃贮存备用，用时稀释。
16 神经细胞培养
取新生SD大鼠脑，在解剖镜下分离出海马，用DHanks洗涤，125g/L胰蛋白酶消化37℃15min，过200目筛网，用含体积分数为15%小牛血清的DMEM/F12培养液终止消化并洗涤，制成单细胞悬液，计数。
17 MTT比色法分析
将细胞悬液加入到预先经过多聚赖氨酸处理的96孔板培养孔中，每孔加入05×10５个细胞(cells)，置37℃、5%(体积分数，下同)CO２培养箱内培养24h，吸出培养液，随机分成高剂量组、低剂量组和对照组，每组12孔，分别加入含体积分数为10%高剂量组、低剂量组和对照组血清的DMEM/F12培养基150μL和稀释的老化Aβ 25～35(终浓度为5μmoL/L)，置37℃、5% CO２培养箱内培养72h。终止培养前4h，每孔加入20μL MTT(5g/L)继续培养，吸出培养基，每孔加入150μL DMSO，摇晃使MTT反应的蓝色产物充分溶解，将培养板放在酶联免疫分析仪上，采用实验波长为595nm和参考波为630nm测每孔样品的光密度(Ｄ)值。各组每次8～12孔，重复3次。
18 NSE免疫组织化学方法分析
将细胞悬液(细胞密度为1×１０５/cm２，即每cm２盖玻片含1×１０５个细胞)接种于24孔板内预先经多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，4h后加入含体积分数为15%小牛血清的DMEM/F12培养液，置37℃、5% CO２培养箱内培养24h，吸出培养液，随机分成高剂量、低剂量和对照组3组，每组3孔，各组分别加入含体积分数20%高剂量组、低剂量组和对照组血清的DMEM/F12培养基1mL稀释的老化Aβ 25～35(终浓度为5μmol/L)，置37℃、5% CO２培养箱内培养48h。弃去培养基，PBS洗3次，40g/L多聚甲醛室温固定15min。NSE免疫组化按SABC免疫组化试剂盒说明书进行，各组每次3～5孔，重复3次。
19 图像分析
半经过NSE免疫组化染色后的盖玻片输入全自动图像处理系统，每张片随机选择3个视野，计数阳性细胞数，测定视野内全部神经细胞的胞体面积(A)最大长径(le，max)、最大短径(lsh，max)和平均突起长度。
20 统计学分析
结果采用SPSS110 for windows统计软件进行分析。
2 结果
倒置显微镜下，刚分离接种的神经元呈圆形：4h后已经贴壁并开始形成短小突触；24h后神经元形态呈圆形，椭圆型，锥形或多角形，1―3个突起；加入Aβ后部分神经元死亡。
21 MTT比色法结果
不同剂量脑还丹含药血清组的光密度值见表1。显示：高剂量组及低剂量组的光密度值升高，与对照组比较有显著性差异(Ｐ＜001)；高剂量组与低剂量组之间无显著性差异。表1 脑还丹含药血清对Aβ诱导的海马神经元细胞MTT法光密度值的影响（略）
22 NSE免疫组化结果
不同剂量脑还丹含药血清培养海马神经元NSE阳性细胞数及神经元胞体面积、最大长径、最大短径和平均突起长度见图及表2。结果显示：高剂量组及低剂量组NSE阳性细胞数、胞体面积、最大长径、最大短径、平均突起长度均高于对照组，差异均有显著性(Ｐ＜005)，高剂量组与低剂量组之间无显著性差异。表2 脑还丹含药血清培养的NSE阳性细胞数、数量和形状比较（略） 转贴于 3 讨论
AD是导致痴呆的最常见的进行性神经变性疾病，在老年人中随着年龄的增加其发病率升高。Aβ是AD病人老年斑中的主要成分，由39-43个氨基酸组成，可溶型无神经毒性，当转变为不溶型时可损害脑内与智力有关的特定结构。许多研究表明Aβ与AD发病有关。淀粉样蛋白前体基因(APP)突变在早发家族性AD病人中已经被检测到［１］。APP转基因鼠的研究也是Aβ在AD病因中作用的一个有力的证据，APP过度表达致基因突变的转基因鼠出现与AD病人类似的神经病理改变及行为异常［２，３］；转APP基因鼠用Aβ免疫治疗可以减轻AD样病理改变更加证实Aβ在AD中的作用［４］。近年来培养的神经细胞已经被用于AD中Aβ诱导神经变性的模型中，由于海马结构与学习记忆功能密切相关，是AD病理损害集中的部位之一，故海马神经元原代培养应用较多。研究表明Aβ对体外培养的神经元具有毒性作用，且已经有实验证实Aβ 25～35与Aβ 1-40所致的神经变性的机制相似［８］。脑还丹是在抗老防衰的古方草还丹的基础上以骨碎补、熟地等组成，该方具有补肾填精、活血通络、涤痰开窍、平衡阴阳的功效。初步研究表明脑还丹能够改善老年性痴呆患者的临床症状［５］；能够提高老齿大鼠血清雌二醇、睾酮水平，降低血粘度，能够提高去势老龄大鼠血清胰岛素样长生因子水平［６］；维持去势老龄大鼠海马CA3区神经元结构和突触密度［７］。本研究在原代培养的海马神经细胞培养液中加入具有神经毒性的老化处理的Aβ 25～35的同时，加入一定浓度的脑还丹含药血清，通过MTT比色法、NSE免疫组织化学方法研究脑还丹的作用，结果表明在原代培养的海马神经细胞培养液中加入Aβ 25～35可导致细胞死亡，而脑还丹含药血清能够抑制Aβ 25～35导致的细胞死亡表现为细胞的存活率增加细胞面积增大及突触长度增长，证明脑还丹对Aβ所致的神经元的损害具有保护作用。鉴于Aβ与AD发病密切相关，故认为这可能是脑还丹治疗老年性痴呆的基础之一。但是Aβ的神经毒性的机理目前仍不清，有研究表明可能与Ca２＋稳态的破坏［９］、Na＋－Ｋ＋－ＡＴＰ酶活性的降低［１０］、神经元凋亡［１１］以及氧化还原障碍［１２］、tau蛋白磷酸化［１３］等有关。脑还丹通过哪一途径起作用有待进一步研究。
参考文献
［１］Goate A，ChartierHarlin M C.Mulan M，et al.Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimers disease［Ｊ］．Nature 1991，349:704.
［２］Moran P M，Higgins L S，Cordell B，et al.Agerelated learning deficits in transgenic mice expressing the 751amino acid isoform of human betaamyloid precursor protein［Ｊ］．Proc Natl Acad Sci USA 1995，92:5341.
［３］Moechars D，Lorent K，De Strooper B，et al.Expression in brain of amyloid precursor protein mutated in the alphasecretase site causes disturbed behavior，neuronal degeneration and premature death in transgenic mice［Ｊ］．EMBO J，1996，15:1265.
［４］Schenk D，Barbour R，Dunn W，et al.Immunization with amyloid beta attenuates Alzheimerdiseaselike pathology in the PDAPP mouse［Ｊ］．Nature 1999，400:173.
［５］李庆明，黄启辉．脑还丹制剂治疗老年痴呆的临床研究［Ｊ］．老年医学杂志，2002，16(6)：169．
［６］程志安，李庆明．脑还丹“对老齿去势大鼠”血清IGFⅠ和血脂水平的影响［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，2001，(1)：38．
［７］程志安，李庆明．脑还丹“对老齿去势大鼠”CA3区及皮质神经元超微结构的影响［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，2002，(2)：31．
［８］Pike C J，Burdick D.Walencewicz A J，et al.Neurodegeneration induced by betaamyloid peptides in vitro:the role of peptide assembly state［Ｊ］．J Neurosci 1993，13:1676.
［９］Mattson M P，Cheng B，Davis D，et al.Amyloid peptides destabilize calcium homeostasis and render human cortical neurons vulnerable to excitotoxicity［Ｊ］．J Neurosci 1992，12:376.
［１０］Mark R J，Hensley K，Butterfield D A，et al.Amyloid βpeptide impairs ionmotive ATPase activities:evidence for a role in loss of neuronal Ca21 homeostasis and cell death［Ｊ］．J Neurosci 1995，15:6239.
［１１］LaFerla F M，Tinkle B T，Bieberich C J，et al.The Alzheimers Aβ peptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice［Ｊ］．Nat.Genet 1995，9:21.
［１２］Behl C.Davis J B.Lesley R，et al.Hydrogen peroxide mediates amyloid beta protein toxicity［Ｊ］．Cell 1994，77:817.
［１３］Busciglio J，Lorenzo A，Yeh J，et al.βAmyloid fibrils induce tau phosphorylation and loss of microtubule binding［Ｊ］．Neuron 1995，14:879.转贴于