双氧水对鼻咽癌细胞生长特性的影响及其机制的初步分析

【关键词】 人低分化鼻咽癌细胞；h3O2；肿瘤相关基因；细胞培养；肿瘤治疗
【摘要】目的: 观察h3O2对人低分化鼻咽癌细胞（CNE2Z）生长、增殖能力的影响，并探讨其可能机制。方法:用MTT及平板克隆形成实验、Western Blot等检测h3O2诱导CNE2Z后增殖能力、EGR1、p53、p16、Cyclin D1的表达。结果：不同浓度h3O2可不同程度地抑制CNE2Z细胞的生长增殖能力，同一时间点各实验组细胞抑制率相比差异有统计学意义，抑制率与h3O2浓度间表现出明显的剂量效应关系。平板克隆形成实验的抑制率较MTT更明显。CNE2Z无EGR1、p16蛋白表达，可见p53、Cyclin D1蛋白表达；诱导培养后EGR1、p53、 Cyclin D1蛋白表达明显增加。结论：一定浓度的h3O2能抑制CNE2Z细胞生长，其作用可能与EGR1及p53蛋白表达增强有关；Egr1基因在CNE2Z中具有可诱导性，在肿瘤治疗中有一定的应用前景。
【关键词】 人低分化鼻咽癌细胞；h3O2；肿瘤相关基因；细胞培养；肿瘤治疗
【Abstract】 Objective: To observe the effects of h3O2 on the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE2Z) and study the possible mechanisms. Methods: The CNE2Z cells were treated with h3O2; the assays of MTT and plate colony formation were used to measure the ability of proliferation of CNE2Z cells; the western blot was used to detect the protein levels of Egr1， p53， p16 and cyclin D1. Results: In a dosage dependent manner， h3O2 inhibited the proliferation of CNE2Z cells， shown by both the MTT and plate colony formation assays with stronger displaying in the plate colony formation assay; without treatment of h3O2 CNE2Z cells express slight p53 and cyclin D1 proteins but no detectable Egr1 and p16 proteins; after treatment with h3O2， CNE2Z express significant higher proteins of Egr1， p53 and cyclin D1 with no detectable change p16 protein. Conclusion: h3O2 might inhibit the proliferation of CNE2Z through increasing the　expressions of Egr1 and p53 proteins; since Egr1 expression was inducible， Egr1 might be a target in the tumor therapy.
【Key words】 nasopharyngeal carcinoma; h3O2; tumor therapy; tumor proliferation
鼻咽癌（NPC）是一种具有显著种族及地理分布特点的恶性肿瘤，以我国华南及东南亚地区高发。鼻咽癌的治疗目前仍以放射治疗为主，但5　a生存率低于50%，远处转移或复发是鼻咽癌患者死亡的主要原因。h3O2可以增强放射抵抗细胞的放射敏感性，放射后细胞ROS (Reactive oxygen species) 生成减少是肿瘤细胞的放射抵抗的重要原因。本实验观察h3O2对鼻咽癌细胞生长、增殖的影响及其相关癌基因的表达。
1 材料与方法
1.1 材料
细胞系:人鼻咽低分化鳞癌细胞系CNE2Z，广东医学院病理学教研室建株保存。
1.2 主要试剂
兔抗人EGR1多抗（Santa Cruz， USA Cat:SC110）；小鼠抗人p53单抗（野生型，英国曼彻斯特Paterson癌症研究中心分子生物系提供）；小鼠抗人p16单抗（DAKO，Cat：SC245）；小鼠抗人Cyclin D1单抗(Santa Cruz，USA Cat:SC19992)；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中山，Cat:ZB2305)；Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz， USA Cat:SC2408)；X线片(Koda，USA)；显影液、定影液(广州天朗涂料化工有限公司)。
1.3 细胞毒实验（MTT法）
取对数生长期细胞（细胞密度为1×105～2×105 /mL），接种于96孔培养板（200μL/孔）。待细胞长成单层后，换以含h3O2 的培养液使其终浓度分别为0、15、25、50　μmol/L，然后分别培养2、4、6　h，再加入MTT 15μL/孔（浓度为5 mg/mＬ），37　℃培养箱中放置4　h后终止培养；吸弃各培养孔内上清液，于每孔加入150μL的二甲基亚砜，震荡摇匀，37 ℃放置2 h，在全自动酶标仪上以波长490nm及570 nm测各孔吸光度，结果以各组6孔OD均值±标准差（±s）表示。计算h3O2对细胞增殖的毒性以抑制率来反映，其抑制率（IR）的计算公式为：细胞抑制率IR（%）=（对照组OD值实验组OD值）/对照组OD值×100%。
1.4 平板克隆形成实验
取对数生长期细胞以每孔300个接种于24孔培养板，观察不同浓度（15、25、50μmol/L）的h3O2 使用液，培养2、4、6 h后，继续常规培养7～10　d。计算每孔的克隆数，50个细胞以上者计为一个克隆，并按以下公式计算克隆形成率。克隆形成率（%）=平均克隆数/接种细胞数×100%；抑制率（%）=（对照组克隆数实验组克隆数）/对照组克隆数×100%。
1.5 Western Blot印迹
取对数生长期细胞分别处理后0 min、15 min、30 min、60 min、2 h、4 h、6 h收集细胞，抽提细胞总蛋白。蛋白定量按BCA试剂盒说明书进行。细胞总蛋白抽提 取对数生长期细胞接种80 mL培养瓶，置于CO2培养箱中培养20　h后，将培养液分别换成空白对照液和50μmol/L的h3O2 使用液继续培养，分别于处理后0　min、15　min、30　min、60　min、2　h、4　h、6　h抽提细胞总蛋白；SDSPAGE 按照操作手册安装BioRad公司的微型垂直板电泳槽，制备0.75　mm厚的聚丙烯酰胺凝胶，注意防止渗漏。根据目的蛋白的分子量确定所需SDSPAGE分离胶的浓度；EGR1、p53和Cyclin D1配制10% SDSPAGE分离胶；p16配制12% SDSPAGE分离胶。转膜；蛋白印迹 EGR1 1∶300，p53 1∶500，Cyclin D1 1∶300，p16 1∶1000。检测EGR1、p53和Cyclin D1蛋白表达，采用图像分析软件Scion Image(Beta 4.0.2版，Scion Corporation，USA.)，测量各蛋白的相对表达量。
1.6 统计学处理
实验数据采用统计学软件SPSS 11.0 进行统计分析，行方差分析、q检验和相关分析，以P&<0.05为差异有统计学意义。 转贴于 2 结果
2.1 不同浓度h3O2对CNE2Z细胞增殖的影响
MTT及平板克隆形成实验结果表明，不同浓度h3O2可不同程度地抑制CNE2Z细胞增殖，同一时间点各实验组细胞抑制率相比差异有统计学意义（P&<0.001），且抑制率与h3O2浓度间表现出明显的剂量－效应关系。平板克隆形成实验之抑制率较MTT更明显。见表1、2。 表1 不同浓度h3O2对CNE2Z细胞系的抑制率（%）― MTT 注：在同一时间范围内，各不同浓度组与对照组比较差异有统计学意义（P&<0.001）。
2.2 Western Blot 结果
CNE2Z细胞缺失EGR1、p16蛋白表达，可见p53、Cyclin D1蛋白表达；50μmol/L h3O2诱导培养后，可见EGR1迅速表达，15 min开始出现，2 h左右即达到最大值，随后表达趋于消失； p53蛋白诱导表达明显增加，与EGR1蛋白表达水平呈正相关（r = 0.883，P = 0.008），其中4　h的相对表达量较其他时间点均高，随后表达减低，差异有统计学意义（P&<0.05）；各时间点Cyclin D1表达差异有统计学意义（P&<0.05），但与EGR1蛋白表达水平无明显相关性（r=0.063，P = 0.089）。
图1 h3O2诱导前后EGR1、p53、Cyclin D1在CNE2Z细胞中的表达
图2 h3O2诱导前后EGR1、p53、Cyclin D1在CNE2Z细胞中的表达
3 讨论
h3O2对肿瘤的发生、发展有双重影响［1］。一方面它具有抑制细胞DNA损伤后修复、形成DNA碱基加成物、影响细胞内信号转导途径、改变细胞粘附特性、促进表达VEGF等多项作用，因而能促进肿瘤的发生与发展；另一方面，h3O2具有诱导细胞凋亡及坏死、抑制细胞增殖等功能，因此又具有一定的抗肿瘤作用。放射线、紫外线及某些抗生素类的抗癌药物治疗肿瘤的机制之一即是通过氧化应激作用来实现的，研究认为肿瘤细胞的放射抵抗至少部分是由于放射后细胞ROS生成减少所致，而h3O2可以增强放射抵抗细胞的放射敏感性，因此探讨h3O2对肿瘤细胞生长、增殖的影响及其机制有一定意义。
本实验结果显示h3O2可诱导EGR1表达，2　h左右即达到最大值，随后表达趋于消失； p53蛋白表达明显增加，与EGR1蛋白表达呈正相关。Egr1是肿瘤细胞的一个抗增殖信号，可促进细胞凋亡［23］； Egr1基因启动子具有可诱导性，辐射可以诱导其蛋白表达，其表达在辐射所致的细胞生长抑制及凋亡中具有重要意义［45］。适当浓度h3O2在体外实验中能一定程度抑制肿瘤细胞生长、增殖，诱导凋亡，h3O2能抑制鼻咽癌细胞生长及凋亡可能与EGR1蛋白的诱导表达有关，其途径可能是通过依赖p53途径起作用。研究表明 NPC 中 p53 基因突变很少见，但是免疫组化证实 p53 过表达比较常见，其原因可能是负责 p53 降解的酶通路失活或是细胞、病毒基因产物干扰了某些功能的结果，而 p53 积聚对鼻咽癌细胞生长有一定优势作用。细胞周期素对维持细胞正常周期进程具有重要意义，其中 Cyclin D１ 在 G1/S 期转换中发挥重要作用［6］。Cyclin D１ 可与 CDK4/6 结合而使 pRb 磷酸化，高磷酸化的 pRb 随之释放转录因子E2F，使细胞由 G1 期进入 S 期，因此 Cyclin D１ 可通过调节细胞周期使之始终处于旺盛分裂状态而促使细胞恶性变。已发现多种肿瘤中都有 Cyclin D１ 的高表达，因此细胞增殖能力旺盛，能够不断分裂增殖而最终形成肿瘤。本实验显示h3O2能诱导Cyclin D１蛋白表达逐渐增强，60 min左右即达到最大值，最后表达趋于减弱，Cyclin D１蛋白表达趋于减弱与EGR1蛋白表达增强密切相关，h3O2能抑制细胞生长及凋亡可能与Cyclin D１表达减弱及EGR1蛋白表达增强有关。p16是目前肿瘤研究中的热点，已证实在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用，其编码产物通过与 Cyclin D１竞争结合 CDK4/6，阻止 pRb 磷酸化，使细胞分裂在G1 期受阻。因此 p16 的功能是通过 pRb 依赖性途径而实现的，并且在体内存在p16、CDK 及 pRb 的负反馈调节环路。当 p16 基因失活时其蛋白不能正常表达，从而增加 Cyclin D１ 与 CDK4/6 的结合，进一步刺激细胞分裂、异常增殖而致肿瘤发生。
　Chung等［7］研究发现在缺失野生型p53的人肺癌细胞系H1299中，h3O2可通过转录因子激活p21途径而使细胞周期阻滞于G2/M期，与我们的实验结果有所差别。由于CNE2Z细胞系中尚存在一个野生型p53等位基因，因此我们推测h3O2可以通过诱导EGR1表达并进一步激活野生型p53而致细胞周期阻滞于G1期，两者可能在h3O2所致的细胞生长抑制及凋亡中起重要作用。我们在实验中发现h3O2可以诱导CNE2Z细胞表达EGR1，EGR1表达有助于提高肿瘤细胞的放射敏感性，因此在肿瘤放射治疗中，联合应用h3O2对某些具有放射抵抗的肿瘤可能具有一定的意义。
参考文献：
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