关于114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC 感染HBV的状况

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　　　　　　作者：王效军 王素萍 李铁钢 冯永亮

【关键词】 外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；原位杂交
【摘要】 目的：了解HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC HBV感染状况。方法：采用原位杂交(ISH)技术检测114例孕妇和新生儿PBMC涂片中HBV DNA。结果：114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC HBV DNA的检出率分别为28.07%（32/114）和32.46%（37/114）；HBsAg阳性孕妇与其新生儿之间的PBMC HBV感染存在一致性（Kappa=0.52， P&<0.01）。结论：证实HBsAg阳性孕妇与其新生儿之间的PBMC HBV感染存在一致性。
【关键词】外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；原位杂交
【Abstract】Objective：To observe the status of HBV infection in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from the HBsAgpositive mothers and their neonates. Methods：In situ hybridization (ISH) was used to detect HBV DNA in PBMC smear from 114 HBsAgpositive mothers and theirs newborns. Results：The positive rates of the PBMC HBV infection of the mothers and their neonates were 28.07% and 32.46%， respectively. There was an agreement of the HBV infection status between the mothers and their newborns (Kappa=0.52， P&<0.01). Conclusion：The result suggests that the HBV infection status from the mothers agrees with that from their newborns.
【Key words】 peripheral blood mononuclear cells; hepatitis B virus; in situ hybridization
乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）宫内感染是导致我国HBsAg慢性携带的重要原因，HBV宫内传播是HBV宫内感染的重要途径，其机制复杂多样。临床上乙肝疫苗（hepatitis B vaccine，HBVac）和乙肝免疫球蛋白（hepatitis B immune globulin，HBIG）的联合应用不能完全阻断HBV母胎之间的宫内传播（intrauterine transmission），有研究［1］证实在HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中均可检出HBV复制中间体（covalently closed circular， cccDNA）。HBV感染PBMC，影响机体体液免疫和细胞免疫状态，导致HBV持续感染或反复感染。史晓红等［2］曾对新生儿HBsAg阳性孕妇新生儿HBV感染作过研究。为进一步了解孕妇及其新生儿PBMC感染HBV的状况，本文采用原位杂交（ISH）技术对此进行了研究，现将结果报道如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
以2003年7月至2004年11月在太原市传染病院妇产科进行产前检查并分娩的HBsAg阳性孕妇及其新生儿为研究对象。采集孕妇分娩前肘静脉血和新生儿出生24 h内未注射乙肝疫苗的股静脉血，EDTA抗凝，抗凝血于4 ℃保存备用。
1.2 实验室检测
1.2.1 PBMC涂片的制备 抗凝血加等量Ficoll淋巴细胞分离液，2000r/min离心30 min；吸取单核细胞层于另一试管，加2 mL Hank，s 平衡盐溶液，1000 r/min离心10 min，再重复洗涤2次 ；洗涤后的细胞用30μLHank，s 溶液制成细胞悬液；取5～10μL涂于经APES（3氨丙基3乙氧基甲硅烷）防脱处理的载玻片上；70%乙醇固定，自然晾干，4 ℃保存备用。
1.2.2 HBV S基因探针的制备 （1） PCP10HBV DNA重组质粒DNA的提取： 吸取1.0～1.5 mL复苏的PCP10质粒培养液于1.5 mL离心管中，4 ℃下14000 r/min离心30 s；吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀重悬于0.5 mLSTE，4 ℃下14000 r/min离心1 min；吸去上清，使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀重悬于冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡后加入200μL新配制的溶液Ⅱ（盖紧管口，快速颠倒5次，不要震荡），置于冰上3 min；加150 μL冰预冷的溶液Ⅲ（盖紧管口，将管倒置后温和地震荡10　s，之后将管置于冰上3～5 min），4 ℃下14000 r/min离心10 min，将上清转移至另一1.5 mL离心管中；加1倍上清体积的酚:氯仿(1∶1)，震荡混匀，4　℃下14000 r/min离心2 min，将上清转移至另一1.5　mL离心管中；加2倍上清体积的95%乙醇，振摇混合，室温静置2 min，14000r/min离心10 min；小心吸去上清，离心管倒置于滤纸上，使所有液体尽量流出，再用滤纸除尽附于管壁的液滴；再加入70%乙醇1mL，4 ℃下14000 r/min离心5 min以洗涤DNA沉淀；再小心吸去上清，离心管倒置于滤纸上，使所有液体尽量流出，用滤纸除尽附于管壁的液滴，空气中干燥10　min，30μLTE缓冲液溶解，-20 ℃保存。（2） HBV S基因双链DNA裸探针的制备及标记：采用PCR法扩增HBV S基因，引物选自HBV S基因启动子和终止子附近的保守序列［3］（189～689　nt），由上海生工生物工程技术有限公司合成，扩增片断长度为500　bp，引物序列为：
HBV SP1 5’CCT GTC CGT GTT ACA GGC 3’ （上游引物）
HBV SP2 5’GGC ATC AGT AAA CTG AGC 3’ （下游引物）
以提取的HBV DNA为模板，以P1 、P2为引物，总反应体积50μL，具体反应体系包括：10×Buffer 5μL、0.025　mol/L MgCl2 4μL、0.01mol/L dNTP1μL、HBV SP1 1μL、HBV SP2 1μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、模板DNA 5μL、无菌水定容至50μL，2滴无菌石蜡油封顶，瞬时离心后，置于PCR扩增仪进行DNA扩增，循环参数为：94℃ 预变性300s，94　℃ 变性 50　s，55　℃ 退火 50　s，72　℃ 延伸 50　s，35个循环，72　℃终延伸300　s，取扩增产物10μL与上样缓冲液混匀，在1.2％琼脂糖凝胶(含0.5　mg/LEB)上电泳，5v/cm，20　min后在紫外灯下观察，与DNAmarker比较，在501　bp附近出现橙红色均一条带为阳性，否则为阴性。紫外灯下回收阳性电泳凝胶块，DNA纯化试剂盒分离纯化，回收HBV S区片断，取少量样品用紫外可见分光光度计定量，以无菌水溶解至约100～300　mg/L即得到HBV S区双链DNA裸探针，参照Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ说明书进行探针标记，20　℃保存。

1.2.3 原位杂交 （1）操作步骤：细胞常规入水5 min，0.01 mol/LPBS漂洗3 min×2；0.2 mol/L HCl室温消化15 min，0.01 mol/L PBS漂洗3 min×3；10 mg/L蛋白酶K37 ℃消化20 min，含0.2%甘氨酸的0.01 mol/L PBS室温终止10 min，0.01 mol/L PBS漂洗3 min×2；梯度乙醇（80%、85%、90%、95%、100%、100%各5 min）脱水，自然风干；加杂交液（含800 mg/L的标记HBV DNA探针，用前42 ℃预热30 min），以25 μL/片滴于PBMC涂片，其上加一盖玻片，95～100 ℃变性10 min， -70 ℃冰面骤冷5 min，然后42 ℃孵育20 h以上；洗片，依次用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC振洗及漂洗；封闭液37 ℃孵育30 min；加抗地高辛碱性磷酸酶标抗体（1∶500），30 μL /片37 ℃孵育2～2.5 h，0.01 mol/LPBS漂洗3 min×3；NBT/BCIP(30μL/片)暗处显色3～5 h；蒸馏水冲洗10 min、甩片；核固红1滴衬染1 min；蒸馏水冲洗3 min×3；透明，依次用75%、85%、95%乙醇各2 min，无水乙醇3 min×2，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2　min；中性树胶封片；镜检照相。（2）对照设置：①阳性对照，PCR证实HBV DNA阳性的PBMC细胞涂片；② 阴性对照，未标记的HBV S区基因裸探针对照；③PBS空白对照。以粉红色细胞中出现深紫色信号判断为阳性，只见粉红色细胞的判断为阴性。
1.3 统计学处理
用SPSS 12.0进行统计学分析，采用一致性检验。
2 结果
114例孕妇及其新生儿PBMC中HBV的感染率分别为28.07%（32/114）和32.46%(37/114)，32例PBMC阳性孕妇新生儿有23例PBMC HBV DNA阳性，82例PBMC阴性孕妇新生儿有14例PBMC HBV DNA阳性，孕妇PBMC HBV感染与新生儿PBMC HBV感染之间存在一致性（Kappa=0.52， Z=5.62， P&<0.01），详见表1。 表1 HBsAg阳性孕妇与新生儿PBMC HBV感染的关系
3 讨论
20世纪80年代以后，学者们从乙型肝炎患者的肝外组织和细胞中发现有HBV的存在与表达，以PBMC中HBV感染的研究相对较多。PBMC是包括淋巴细胞、单核细胞以及NK细胞等免疫活性白细胞的集合体，在机体的免疫应答中担负重要的免疫功能。HBV感染PBMC后能改变其分泌功能，影响机体的细胞和体液免疫。因此，PBMC HBV感染对乙肝病毒的清除、持续携带以及免疫耐受等结局将起重要作用。本文应用ISH在孕妇及新生儿PBMC中均检出HBV DNA，证实了PBMC可作为HBV的隐匿场所。
PBMC HBV感染的检测以孕妇PBMC较多［4］，新生儿PBMC HBV感染的文献相对较少。由于研究方法和研究对象的差异，感染率有所不同。Poovorawan等［5］的研究结果显示，HBsAg单阳性及HBsAg、HBeAg双阳性孕妇PBMC HBV检出率分别为69.2% (9/13)和94.7% (18/19)，在其研究的34例新生儿PBMC中均未检测到HBV DNA。国内王素萍等［2］采用原位PCR和ISH法，发现在血清HBV DNA阳性和阴性新生儿PBMC中 HBV DNA的检出率分别为49.09%（55/93）和10.53%（4/38）。史晓红等［2］应用选择性PCR，发现在HBsAg阳性孕妇新生儿PBMC中HBV DNA的检出率为23.84％(36/151)与本文结果相近，进一步证实ISH检测PBMC HBV DNA是稳定、可靠的。
本文采用ISH技术检测的114例母婴中，HBsAg阳性孕妇PBMC HBV感染率为28.07％（32/114），新生儿PBMC HBV感染率为32.46％（37/114），两者的感染存在一致性（Kappa=0.52， Z=5.62， P&<0.01），与既往应用PCR技术进行的类似研究［6］所得结论一致，提示检测新生儿PBMC HBV感染在研究HBV宫内传播方面有重要意义。

参考文献

［1］ 史晓红，王素萍，李淑珍，等.HBsAg阳性孕妇及新生儿HBV复制状况的研究［J］.中国公共卫生，2004，20(5):513514.
［2］ 史晓红，王素萍，李淑珍，等.太原市HBsAg阳性孕妇新生儿HBV感染状况的研究［J］.山西医科大学学报，2004，35(1):1819，24.
［3］ 范金水，庄辉，朱晓洁，等.我国6城市HBsAg阴性和阳性乙肝临床和流行病学特点的比较研究［J］.中华预防医学杂志，1996，30(增刊):1719.
［4］ 钱小虎，叶庆华，乔福元.荧光原位杂交研究乙型肝炎病毒在孕妇外周血淋巴细胞染色体上的整合［J］.上海医学，2003，26(10):708709.
［5］ POOVORAWAN Y， CHONGSRISAWAT V， THEAMBOONLERS A， et al. Is there evidence for intrauterine HBV infection in newborns of hepatitis B carrier mothers［J］. Southeast Asian J Trop Med Public Health，1997，28(2):365369.
［6］ 王效军，王素萍，李铁钢，等.孕妇新生儿外周血单核细胞HBV感染状况及危险因素分析［J］.预防医学情报杂志，2004，20(4):355357.