关于RPHPLC测定血脉通片中丹参酮ⅡA的含量

　　　　　　作者：廖华卫 朱彩燕 邓金梅 林茵

【摘要】 目的 建立血脉通片中丹参酮ⅡA的含量测定方法。方法 采用RPHPLC法，色谱柱：KromasilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水（体积比85∶15）；检测波长：270 nm流速：1 mL·min-1 。结果 丹参酮ⅡA在0.3232 μg～1.616 μg范围内有良好的线性关系，平均回收率是100%(RSD＝0.72％）。结论 本法操作简单、准确、重复性好，可用于血脉通片的质量控制。
【关键词】 反相高效液相色谱法；血脉通片；丹参酮ⅡA

　　Abstract:Objective To set up a RPHPLC method for determining the content of tanshinone ⅡA in Xuemaitong tablets. Methods Tanshinone ⅡA was analyzed on a Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column using methanolwater(85∶15) as mobile phase. The flow rate was 1 mL·min-1 and the detection wavelength 270 nm. Results The linear range of tanshinone ⅡA was 0.3232-1.616 μg and the average recovery was 100% with RSD 0.72%.Conclusion The method is simple， accurate， reproducible and rapid， which can be used for the quality control of Xuemaitong tablets.
　
　　Key words:RPHPLC; Xuemaitong tablet; tanshinoneⅡA
　　血脉通片由丹参、川芎、葛根、三七、冰片等药材组成，具有活血化淤、补中益气、利水逐邪的功效。临床上主要用于淤血闭阻引起的胸痹、胸闷、胸痛等症状，对冠心病、心绞痛均有良好的效果。
　　丹参为方中君药，其有效成分是脂溶性二萜化合物和水溶性酚酸类化合物，包括丹参酮ⅡA、丹酚酸B等。近年来，大量的临床和药理学实践表明，丹参对肝脏、心脏具有明显的药效作用，丹参能明显抑制肝细胞、心脏细胞脂质过氧化反应，增加超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛含量，使肝细胞、心脏细胞变性坏死减弱；而丹参酮ⅡA药理作用明显，是一种新的有效的细胞内脂质过氧化产物与DNA相互作用的抑制剂［1-3］。
　　为了有效地控制该制剂的质量，保证临床用药的疗效稳定、安全可靠，本文建立了测定血脉通片中丹参酮ⅡA的反相高效液相色谱含量测定方法，该方法灵敏度高、操作简便、快速、结果准确可靠、专属性强、重复性好，可用于血脉通片制剂的质量控制。
　　 1仪器与试药
　　
　　WATERS2695/2996型高效液相色谱仪（美国）；自动进样器；Empower色谱工作站；
　　
　　血脉通片（广东药学院中药药剂教研室自制）；丹参酮ⅡA（0766－200011，中国药品生物制品检定所，供含量测定用）。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
　　2方法与结果
　　2.1色谱条件及系统适用性试验
　　
　　色谱柱：KromasilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水（体积比85∶15）；流速：1 mL·min-1；检测波长：270 nm；柱温：28 ℃；进样量：20 μL。在此条件下，供试品中丹参酮ⅡA峰与其他组分峰能达到基线分离，丹参酮ⅡA峰保留时间约为11 min，理论板数按丹参酮ⅡA峰计应不低于2 000；分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05范围内。见图1。
　　2.2阴性对照试验
　　
　　按处方量以相同工艺制备缺丹参的阴性对照，按上述方法测定，结果阴性对照色谱图中在与丹参酮ⅡA对照品色谱图相对应的保留时间处无色谱峰出现，其他成分对丹参酮ⅡA测定无干扰，见图1。A.丹参酮ⅡA对照品；B.血脉通样品；C.阴性样品
　　图1血脉通HPLC图谱　略
　　2.3样品溶液的制备
　　2.3.1对照品溶液的制备
　　
　　精密称取丹参酮ⅡA对照品16.16 mg置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到0.161 6 mg/mL的丹参酮ⅡA对照品储备液。精密量取1 mL至10 mL量瓶中，得浓度为0.016 16 mg/mL的丹参酮对照品溶液。

　2.3.2供试品溶液的制备
　　
　　取本品20片，去糖衣，研细，精密称取约2 g，置100 mL锥形瓶中，加甲醇约30 mL，超声处理30 min，滤过，残渣加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，合并滤液，将容器和滤纸多次洗涤液并入滤液中，水浴挥干，加甲醇溶解并转移置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
　　2.4线性关系考察
　　
　　精密量取丹参酮ⅡA对照品贮备液(0.161 6 mg/mL)2、3、4、6、10 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定丹参酮ⅡA色谱峰面积，以丹参酮ⅡA进样量（m)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，计算得回归方程A=1.26×10-7m-7.71×10-4(r=0.999 8)，线性范围0.323 2～1.616 μg，结果表明在此范围内呈良好的线性关系。
　　2.5精密度试验
　　
　　取上述对照品溶液20 μL ，重复进样6次，测得峰面积的RSD=0.69%。
　　2.6稳定性试验
　　
　　取上述供试品溶液20 μL，分别在0、2、4、6、8、12、18、24 h进样测定，峰面积的RSD=0.88%(n=6)，表明样品在24 h以内稳定。
　　2.7重复性试验
　　
　　取供试品(批号061118)6份，每份约2 g，精密称定。按“2.3”项下方法制备并测定，测得丹参酮ⅡA平均含量分别为0.404 mg/g、RSD=1.09%，表明方法重复性好。
　　2.8加样回收率试验
　　
　　取已知含量供试品1 g(批号:061109， 丹参酮ⅡA含量0.421 mg/g)，加入定量的丹参酮ⅡA对照品，依样品测定项下的方法测定，计算其丹参酮ⅡA平均回收率=99.95%，RSD=0.72%(n=6)，结果见表1。
　　表1丹参酮ⅡA回收率测定结果　略
　　2.9样品测定
　　
　　分别吸取对照品和供试品溶液各20 μL，按上述方法测定供试品中丹参酮ⅡA含量，结果3个批号的样品061120、061230、060702其含量分别为0.404、0.402、0.405 mg/g。
　　3讨 论
　　3.1测定时应注意掌握样品的前处理，曾经分别用索氏提取、回流提取、超声提取等方法对样品进行处理，结果以超声提取2次较完全且操作简单快捷。
　　3.2经过比较不同比例的甲醇水(体积比60∶40)、(体积比70∶30)、(体积比85∶15)及乙腈水(体积比70∶30)等流动相系统对本品中丹参酮ⅡA与杂质的分离度与保留时间，发现流动相甲醇水(体积比85∶15)能保证所测样品与杂峰分离完全(分离度＞1.5)，色谱峰峰形对称而尖锐(拖尾因子=1.00)。
【参考文献】
　　［1］ 崔小鹏，李厚祥，沈洪薰，等.丹参对大鼠肝细胞凋亡及相关基因表达的影响［J］.南通医学院学报，2003，23（4）：410-413.

　　［2］ 陶艳艳，刘成海.丹参及其化学成分抗肝纤维化作用机制研究进展［J］.中西医结合学报，2004，2（2）：145-148.

　　［3］ 田葆苹.丹参及其制剂的体内药代动力学研究概述［J］.中国药房，2002，14（6）：375-377.

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