关于反相高效液相色谱法测定人血浆中艾司西酞普兰的浓度

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　　　　 作者：温预关 廖日房 曾转萍 邓超连

【摘要】 目的 建立测定人血浆中艾司西酞普兰浓度的HPLCFLD法。方法 以DiamonsilTM C18反相柱（250 mm×4.6 mm，５ μm）为色谱柱，流动相为乙腈0.03 mol·L-1醋酸铵（体积比45∶55，调pH=6.0），流速为0.8 mL·min-1，激发波长：235 nm，发射波长307 nm，以正己烷异戊醇（体积比95∶5）为提取剂。结果 艾司西酞普兰的高（25 μg·L-1）、中（10 μg·L-1）、低（1.5 μg·L-1）3个浓度的平均回收率分别为95.29%、97.01%和97.22%，日内（n=5）、日间（n=3）RSD均小于15%；分析方法的最低定量限为0.5 μg·L-1，线性范围为0.5～50 μg·L-1，回归方程为ρ=20.93A-0.015，r=0.999 9（n=7）。结论 该方法灵敏、准确、简单、快速，可用于临床血浓监测和药动学研究。
　　
【关键词】 艾司西酞普兰；血药浓度；反相高效液相色谱法

　　Abstract:Objective To set up an RPHPLC method for content determination of escitalopram in human plasma.Methods Escitalopram was extracted with hexaneisoamyl alcohol. The residues were analyzed on an RPHPLC column (Diamonsil C18， 5 μm， 4.6 mm×250 mm) using a mobile phase consisting of acetonitrile0.03 mol·L-1 NH4Ac (45∶55，pH6.0). The fluorimetric excitation and emission wavelength was 235 and 307 nm， respectively.Results The average recoveries of three concentrations of escitalopram(25，10， 1.5 μg·L-1) were 95.29%， 97.01% and 97.22%， respectively. Inter (n=3) and intraday(n=5) assay RSD were less than 15%. The calibration curve was linear over the range of 0.5-50 μg·L-1 ( r = 0.999 9， n=7）and the limit of quantitation for escitalopram was 0.5 μg·L-1. Conclusion The method is sensitive， accurate， precise and reliable for clinical monitoring of plasma escitalopram.
　　Key words:escitalopram；plasma concentration；RPHPLC
　　艾司西酞普兰(escitalopram，ETP)是新一代的抗抑郁药物，其对5羟色胺重吸收抑制剂的相对选择性在同类药物中最高，能有效抑制5羟色胺的再摄取，具有很强的抗抑郁作用。目前该药由西安杨森制药股份有限公司首次在国内上市。其检测方法国外采用高效液相色谱法［1-2］和LCMS检测法［3］。为便于进行血药浓度监测和药动学研究，本文参照文献［4］建立了以度洛西汀为内标的测定人血浆中艾司西酞普兰浓度的HPLCFLD法。
　　1仪器与试药
　　1.1仪器
　　
　　Agilent1100 HPLC仪配荧光检测器G1321A，G1313A自动进样器，G1311A自动调配泵，G1316A可调柱温恒温箱，Agilent色谱化学工作站（美国惠普）；旋涡混合器（原上海医科大学仪器厂）；电子天平（瑞士SARTORIUS）；MICRO1224高速离心机（美国）；MMMGROUP真空干燥箱（德国）。
　　1.2药品和试剂
　　　
　　草酸艾司西酞普兰对照品(西安杨森制药有限公司，批号：050608，质量分数&>99.5%)，内标物为度洛西汀（美国礼来公司，批号：050621，质量分数&>99.8%）。乙腈（色谱纯，迪马公司），水为超纯水，其余均为分析纯。
　　1.3对照品和内标溶液
　　　
　　精密称取草酸艾司西酞普兰适量（含艾司西酞普兰10.0 mg）加乙腈溶解并定容至10 mL，于冰箱4 ℃避光保存。临用时用乙腈水（体积比50∶50）稀释成所需浓度的艾司西酞普兰对照品溶液。度洛西汀浓度为10 mg·L-1的乙腈溶液。
　　2方法与结果
　　2.1色谱条件
　　　
　　DiamonsilTM C18反相柱为色谱柱（迪马公司，4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为乙腈0.03 mol·L-1 醋酸铵（体积比46∶54），用甲酸调pH＝6.0），流速0.8 mL·min-1，柱温30 ℃；激发波长：235 nm，发射波长307 nm。艾司西酞普兰和度洛西汀的保留时间分别为6.3 min和8.5 min。见图1。
　　图1艾司西酞普兰HPLC色谱图 　略
　　2.2样品处理
　　
　　取1 mL含药血浆加至10 mL锥形玻璃离心管中，加入10 mg·L-1的度洛西汀溶液50 μL，快速振荡5 s，加入0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液0.2 mL，振荡5 s。加入3 mL正己烷异戊醇（体积比95∶5）密塞，旋转振荡30 s，3 000 r·min-1离心10 min，吸取有机层转入5 mL锥形玻璃离心管内，30 ℃真空干燥至干。进样前加入0.1 mL乙腈水(体积比50∶50)溶解，快速振荡10 s溶解残渣，吸取10 μL进样。
　　2.3标准曲线的制备
　　　
　　取空白血浆1 mL 8份，分别加入0、10、20、50、100、200、500、1 000 μg·L-1浓度的艾司西酞普兰对照品溶液，振荡5 s，使血浆药品质量浓度相当于0、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg·L-1，然后按血样处理方法处理。经HPLC分析，测得ETP峰面积与内标峰面积之比（A）作横坐标，以血浆ETP质量浓度(ρ)为纵坐标，得到0.5.～50 μg·L-1范围的血浆ETP浓度标准曲线。直线方程为：ρ=20.93A-0.015，r=0.999 9。当RS/N=3时，最低检测浓度为0.5 μg·L-1。分别取5个不同来源空白血浆1 mL，分别加入10 μg·L-1的艾司西酞普兰乙腈溶液50 μL，按照“2.2”项操作，测得结果为(0.54±0.03) μg·L-1，RSD为4.75%。
　　2.4回收率及精密度试验
　　
　　取高、中、低3种浓度（25、10、1.5 μg·L-1）制作提取前和提取后的２组样品，经色谱分析，以峰面积比较，得到的提取回收率均大于90%。按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度样品，在1 d内和分散于2周内测定其浓度，计算日内、日间误差及相对回收率。结果见表1。
　　2.5血浆样品的稳定性试验
　　
　　按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度（25、10、1.5 μg·L-1）的3组血浆样品，分别在室温（放置6、12、24 h ）、长期冻存（-20 ℃冻存1、2、3 星期）和冻融（1、2、3次）条件下分别进行色谱测定，结果见表2。
　　表1回收率与日内、日间精密度　略
　　表2稳定性考察　略
　　2.6质控样品的监控
　　
　　按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度（25、10、1.5 μg·L-1）置-20 ℃冻存，备用，此即为质控样品。每天检测血样品前须按照“2.3”项方法制作随行标准曲线及检测高、中、低3种浓度双份质控样品，如果相对回收率均在85%～115%（低浓度可在80%至120%之内）内时，即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。

　2.7临床检测实例
　　
　　40例抑郁症患者，男25例，女15例，年龄19～73岁，平均(23±11）岁，连续服药14 d血药浓度达稳态后测定艾司西酞普兰浓度，结果：15例口服5 mg·d-1，平均稳态血药浓度为（15.14±8.00） μg·L-1；22例口服10 mg·d-1，平均稳态血药浓度为（19.08±8.81） μg·L-1；3例口服15 mg·d-1，平均血药浓度为（62.08±23.74） μg·L-1。
　　3讨 论
　　3.1测定波长的选择
　　
　　在激发波长220～400 nm和吸收波长300～500 nm范围进行扫描，发现最大激发波长为235 nm，最大吸收波长为307 nm，与文献［4］报道的236 nm和306 nm相似。
　　3.2流动相的选择
　　
　　曾试用乙腈0.03 mol·L-1醋酸铵为流动相，按不同配比均发现艾司西酞普兰峰拖尾，峰形对称性不理想；用甲酸调pH值为6，乙腈0.03 mol·L-1醋酸铵的体积比为45∶55时，峰形对称，半峰宽窄；设定流速为0.8 mL·min-1时，柱温为30 ℃时，出峰时间理想，检测时间比文献［4］的时间缩短5 min，故采用此色谱系统。
　　3.3提取溶剂的选择
　　
　　分别曾试用乙醚、正己烷、醋酸乙酯、乙腈、氯仿和正己烷异戊醇为提取剂，经过比较发现在正己烷异戊醇（体积比95∶5）中的提取率最高，故采用此混合溶剂作为提取剂。
　　3.4 内标物的选择
　　
　　经过对β萘酚、盐酸普萘洛尔、替米沙坦、度洛西汀等物质或药物的比较发现，替米沙坦与艾司西酞普兰色谱峰分不开，β萘酚和盐酸普萘洛尔相离太远，均不是理想的内标物，而度洛西汀与艾司西酞普兰提取条件相似，且色谱峰分得开，内源性物质不干扰，故选择度洛西汀为内标物。
　　
　　本文方法操作简单、快速，检测结果准确、灵敏度高、重复性好，检测定量限为0.5 μg·L-1，低于文献［5］报道的1.3 μg·L-1，可作为临床常规艾司西酞普兰的血浓监测及其药动学研究的方法。
【参考文献】
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　　［3］ SMYTH W F， LESLIE J C， MCCLEAN S， et al. The
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　　［5］ 刘晓，张相林，李凯鹏，等.高效液相色谱-荧光法测定人血浆中西酞普兰含量［J］.药物分析杂志，2005，25(10): 1186.