关于高效毛细管电泳法测定广地龙饮片中琥珀酸的含量

【摘要】 目的 测定广地龙饮片中琥珀酸的含量。方法 采用高效毛细管电泳法，以未涂层融硅毛细管（50 cm×75 μm）为分离柱，1 mmol/L三（羟甲基）氨基甲烷10 mmol/L H3BO30.5%四乙烯五胺0.025 mmol/L溴化十六烷基三甲胺（pH=11.45)体系为电泳介质，采用重力进样，进样时间15 s，进样高度20 cm，分离电压10 kV。结果 该方法的线性范围为5.00～80.00 μg/mL，平均回收率为98.41%，RSD=2.21% (n=9 )，广地龙饮片（产地：广西）中的琥珀酸含量为0.8 mg/g。结论 方法可行，重现性好，能有效地控制广地龙饮片的质量。
【关键词】 广地龙；琥珀酸；高效毛细管电泳法
　　Abstract:Objective To determinate the content of succinic acid in dried Pheretima aspergillum (E.Perrier) Methods The content of succinic acid was determined with high performance capillary electrophoresis (HPCE) Results The linear relationship was at the range of 5.00 μg/mL～80.00 μg/mL .The average recovery was 98.41% (RSD=2.21% and n=9). The content of succinic acid was 0.8 mg/g in dried Pheretima aspergillum (from Guangxi) Conclusion The method is reliable with a good reproducibility and can be used in quality control.
　　Key words:Pheretima aspergillum; succinic acid；HPCE
　　广地龙为钜蚓科动物参环毛蚓［Pheretima aspergillum(E.Perrier)］的干燥体，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效，临床应用于高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肢体麻木、半身不遂、肺热喘咳、尿少水肿、高血压［1］。曾有文献报道，采用薄层扫描法测定广地龙药材中琥珀酸含量［2］，但该法对样品的处理非常繁琐，需要柱层析进行分离纯化，且TLC进行定量精确度较差。本课题组也曾对不同产地广地龙饮片中的次黄嘌呤含量进行测定［3］，本文采用高效毛细管电泳法（HPCE）测定广地龙饮片中琥珀酸含量，为进一步评价广地龙的质量提供依据。
　　
　　1仪器、试药
　　1.1仪器
　　
　　CES2000HVIB毛细管电泳仪（负高压电源，电导检测器，毛细管电泳数据工作站，中山大学化学与化工学院研制）；DL360A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；恒温水浴箱（江苏金坛市仪器有限公司）；AY120电子天平（日本岛津）；ASC3C计重秤（广东省中山市新和基科技开发有限公司）；WH2000超声波雾化器（汕头市粤华医疗器械厂有限公司）。
　　1.2试药
　　
　　琥珀酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110896-200202）；广地龙饮片（产地广西）经广东药学院刘基柱副教授鉴定为参环毛蚓［Pheretima aspergillum(E．Perrier)］的干燥体；三（羟甲基）氨基甲烷（Tris），分析纯；溴化十六烷基三甲胺（CTAB），分析纯；超纯水；其他试剂均为市售分析纯。
　　
　　2方法与结果
　　2.1溶液的制备
　　2．1．1对照品储备液精密称取琥珀酸对照品50 mg至50 mL容量瓶中，加蒸馏水配制成1.00 mg/mL的对照品储备溶液。
　　2．1．2供试品溶液取广地龙药材（产地广西），粉碎，精密称取0.5 g，置50 mL带塞锥形瓶中，加入90%（体积分数）乙醇液20 mL，超声提取45 min，滤过，50 ℃水浴挥干，残渣用20.00 mL水溶解，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试液。
　　2.2电泳条件
　　　
　　以未涂层熔融石英毛细管（50 cm×75 μm）为分离柱，1 mmol/L Tris10 mmol/L H3BO30.5%四乙烯五胺0.025 mmol/L CTAB（pH=11.45)体系为电泳介质，采用重力进样，进样时间15 s，进样高度20 cm，分离电压10 kV，毛细管电泳色谱图见图1。
　　A. 对照品；B.广地龙饮片1.琥珀酸

　　图1广地龙毛细管电泳色谱图　略
　　2.3线性关系考察
　　
　　精密量取适量的储备液，分别配成5.00、10.00、20.00、40.00、60.00和80.00 μg/mL的琥珀酸对照品溶液，分别进样测定，以峰面积（A）为纵坐标，以对照品的质量浓度（ρ）为横坐标，进行线性回归，得线性方程A=5.589×104ρ+46.38，r=0.999 8，结果显示，在5.00～80.00 μg/mL范围内，琥珀酸的质量浓度和峰面积的线性关系良好。
　　2.4精密度试验
　　
　　取同一对照品（20 μg/mL）溶液，连续重复进样6次，结果琥珀酸峰面积的RSD=1.37%。
　　2．5稳定性试验
　　
　　取同一供试品溶液，分别于制备后每间隔3 h测定1次，结果琥珀酸峰面积RSD=1.89%（n=6），表明供试品溶液在48 h内稳定。
　　2.6重现性试验
　　
　　将广地龙药材平行提取制备6份供试品溶液，分别进样测定，结果RSD=2.15% (n=6)。
　　2.7加样回收率试验
　　
　　精密称取已知含量的广地龙药材粉末0.25 g各9份，分别加入琥珀酸0.24 mg、0.20 mg和0.16 mg各3份，按“供试品溶液”项的步骤提取，测定，得平均回收率为98.41%，RSD=2.21%(n=9)，见表1。
　　2.8样品测定
　　
　　按照“供试品溶液”的制备方法，0.45 μm微孔滤膜过滤后进样，5个批号广地龙饮片（广西）琥珀酸含量平均为0.8 mg/g (n=5)。
　　表1琥珀酸回收率试验　略
　　3讨 论
　　3.1毛细管电泳法具有快速、运行成本低等特点。本文采用毛细管电泳法测定琥珀酸的含量，简单快速，重现性好。
　　3.2本文作者曾比较不同产地的广地龙饮片中次黄嘌呤的含量，以产地为广西的含量最高，达到1.10 mg/g［3］。本文的结果显示，广西产的广地龙其琥珀酸的含量也达到0.8 mg/g。此2种成分是否可作为广地龙的有效控制指标成分，有待进一步做药效学研究。

参考文献

　　［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学工业出版社会，2005：80-81.

　　［2］ 王光忠，邹阳，陈敬炳，等.薄层扫描法测定地龙类药材中琥珀酸的含量［J］.药物分析杂志，1997，17（4）：274-275.

　　［3］ 李坚，龙晓英，何琳，等.HPLC测定不同产地广地龙次黄嘌呤含量［J］.中药材，2006(5)：448-449