关于正交试验优选肿节风的提取工艺

　　　　　　作者：伍振峰，何伟，李勇，马建春

【摘要】 目的 优选肿节风最佳提取工艺。方法 以高效液相色谱法测定异嗪皮啶含量，以紫外分光光度法测定总黄酮含量，采用正交试验优选提取工艺条件。结果 优选得到的工艺条件为：50%（体积分数）乙醇，7倍量，提取3次，每次1.5 h。结论 优选工艺条件提取率高，可为工业化生产提供实验依据。
【关键词】 正交试验；肿节风；提取工艺；异嗪皮啶；总黄酮
Abstract:Objective To optimize the extraction procedure of Sarcandra glabra．Methods The contents of isofraxidin and total flavonoids were determined by HPLC and UV spectrophotometry， respectively. Extraction procedure was optimized by orthogonal test．Results The optimal extraction conditions were as follows：50％ of alcohol， 7 of solidtoliquid ratio， three 1.5 h of extraction cycles. Conclusion The method has high extraction efficiency，and could be used for scaleup.
　　Key words:orthogonal test；Sarcandra glabra；extraction procedure；isofraxidin；total flavonoids
　　 肿节风系金粟兰科（Chloranthaceae）草珊瑚属植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thumb.) Nakai的干燥全草，又名九节茶、接骨草、草珊瑚，其味苦、辛，性平，具清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效［1］，主要含有异嗪皮啶(isofraxidin)等香豆素类化合物及落新妇苷(astilbin)等黄酮类成分［2］，主产于广东、广西、江西等地，《中国药典》2005年版一部将其收载为正品药材。本文以高效液相色谱法测定肿节风提取液中异嗪皮啶的含量，以紫外分光光度法测定总黄酮的含量，应用多指标综合评分法对正交试验结果进行分析，为肿节风相关制剂的研究开发提供参考。
　　1 仪器与材料
　　1.1 仪器
　　Dionex ultimate 3000高效液相色谱仪（光电二极管阵列检测器、Chromeleon色谱工作站）；BS224S型电子分析天平（北京Sartorius）；UV1101型紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。
　　1.2 材料
　　芦丁对照品（批号：100080200306，含量测定用）、异嗪皮啶对照品（批号：110837200304 含量测定用），均购于中国药品生物制品检定所；肿节风药材：购于广州致信药业有限公司，经鉴定符合《中国药典》2005年版一部肿节风项下标准；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。
　　2 方法与结果
　　2.1 正交试验设计
　　依据预试验结果，以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数为考察因素，每因素设3个水平，采用L9（34）正交试验表安排试验（见表1）。表1 因素水平表表2 正交试验结果
　　2.2 异嗪皮啶含量测定
　　2.2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：乙腈0.2%磷酸溶液（体积比20∶80）；检测波长：344 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。
　　2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取异嗪皮啶对照品0.010 5 g， 用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，精密吸取2 mL，用甲醇定容至50 mL，得质量浓度为0.042 mg/mL的对照品储备溶液。
　　2.2.3 供试品溶液的制备 称取肿节风药材20 g，置500 mL的圆底烧瓶中，按表2条件提取，滤过，分别定容至500 mL量瓶中，作为样品溶液。精密量取样品溶液25 mL，用提取溶剂分别定容至50 mL，精密吸取5 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。
　　2.2.4 标准曲线的制备 精密吸取异嗪皮啶对照品储备溶液1、2、3、5、10、15 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇定容，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，精密吸取20 μL注入液相色谱仪，按上述条件测定异嗪皮啶吸收峰峰面积，以异嗪皮啶微克数为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y＝948.96X+0.02，r=0.999 9，表明异嗪皮啶进样量在0.033 6～0.504 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
　　2.2.5 含量测定 精密吸取供试品溶液、对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定异嗪皮啶峰面积，计算异嗪皮啶含量。
　　2.3 总黄酮含量测定［3］
　　2.3.1 标准曲线的制备 精密称取芦丁对照品20.8 mg，置100 mL量瓶中，加体积分数为60％的乙醇溶解并定容至刻度，分别精密吸取0、2、3、4、5、6、7 mL，置25 mL量瓶中，分别加体积分数为60％的乙醇补足至7 mL，加入质量分数为5％亚硝酸钠1.0 mL，摇匀，静置6 min，加入质量分数为10％硝酸铝1.0 mL，摇匀，静置6 min，再加入质量分数为4％的氢氧化钠10.0 mL，用体积分数为60％的乙醇定容至25 mL，摇匀，静置10 min后，用可见－紫外分光光度计于510 nm处测吸光度。以芦丁对照品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：

　　Y=11.717X-0.006，r=0.999 9
　　线性范围为0.016 64～0.058 24 mg/mL。
　　2.3.2 供试品溶液的制备 取“2.2.3”项下的溶液25 mL定容至50 mL量瓶中，精密吸取20 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣用体积分数60％乙醇溶解并定容至25 mL，滤过，作为供试品溶液。
　　2.3.3 含量测定 精密吸取供试品溶液2 mL置25 mL量瓶中，按“2.3.1”项下方法操作，测定吸光度值，计算样品中总黄酮的含量。
　　2.4 正交试验结果及分析
　　按异嗪皮啶含量和总黄酮含量各占50％的权重综合评分，对正交试验结果进行极差和方差分析，试验结果见表2。从结果可知，因素D对提取效率有显著性影响（P&<0.01），其他各因素排序为B＞A＞C，优选工艺条件为A2B3C3D3。由于因素B、C对提取效果的影响较小，结合生产成本考虑，进一步对A2B2C2D3与A2B3C3D3进行比较验证试验。结果异嗪皮啶含量分别为0.475 5 mg/g和0.477 9 mg/g，总黄酮含量分别为0.046 4 g/g和0.047 3 g/g，表明两者差异无显著性。确定提取工艺为A2B2C2D3，即50%(体积分数)乙醇、7倍量、每次提1.5 h，提取3次。
　　3 讨 论
　　3.1 本试验总黄酮的含量测定是参照文献［３］的方法进行，但在实验过程中发现，样品随放置时间延长，吸光度测定值逐渐减小，而且结果相差较大。因此，在试验的过程中应严格控制各个步骤的操作时间，保证各样品在同一条件下测定。
　　3.2 总黄酮和异嗪皮啶是肿节风药材的有效成分，体外抗肿瘤活性试验表明，异嗪皮啶具有抑制肿瘤细胞生长的作用，总黄酮对小鼠艾氏腹水癌实体型有一定的抑制作用［４，５］。本文采用高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法分别测定异嗪皮啶和总黄酮的含量，并选择多指标综合评价方法确定最佳工艺条件，使所选工艺条件更合理可行。
【

参考文献

】
［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典：2005年版一部［S］．北京：化学工业出版社，2005：154．

［2］ WING Yantsui，GEOFFREY D B．Cycloeudesmanolides from Sarcandra Glabra［J］．Phytochemistry，1996，43(4)：819-821．

［3］ 王敦清，李先春．草珊瑚根茎叶中总黄酮成分的研究［J］．中草药，1996，27（6）：237-238．

［4］ 王菲，袁胜涛，朱丹妮．肿节风抗肿瘤活性部位的化学成分［J］．中国天然药物，2007，5（3）：174-178．

［5］ 周金煦，陆丽娟，胥彬，等．肿节风抗肿瘤作用的研究［J］．肿瘤，1988，8（5）：261．