关于三种检测AmpC酶方法的比较

　　　　　　作者：陈林珍，李晓穗，刘一鸣，邹燕

【关键词】 表型筛选法
　　摘要:目的 采用三维试验、表型筛选法及头孢西丁纸片药敏法(K-B法)同时检测肠道G-杆菌的AmpC酶，并加以比较，找出一种适合临床常规应用的检测AmpC酶的方法。方法 用头孢硝噻吩法检测出97株β内酰胺酶阳性的肠道G-杆菌作为试验待测菌，用头孢西丁药敏法、表型筛选法测定细菌耐药情况，以判断产AmpC酶的情况。用三维分析法测定细菌粗提物中的AmpC酶情况。 结果 97株肠道杆菌头孢西丁药敏法结果显示产AmpC酶共有36 株，占37.1%（36 /97），与三维试验比较总符合率为74.2%。表型筛选法产AmpC酶的菌株有15株，占15.5%（15/97），与三维试验比较总符合率为91.8 %。结论 表型筛选法与三维试验法比较差异无显著性。表型筛选法可以作为一种临床快速、简便、可靠的检测AmpC酶的方法。
　　关键词:头孢西丁药敏法；三维试验；表型筛选法；AmpC酶
　　Abstract: Objective using three dimensional taest，phenotype screening taest and Cefoxitin sensitive test to detect AmpC enzyme of intestinal G- Bacillus，then compare and set up a new convenient routine method in clinical laboratoies. Methods Using nitrocefin test 97 βlactams nezymes(+)intestinal Bacillus as test.Cefoxitin sensitive test and phenotype screening were performened to detect the resistance in 97 intestinal Bacillus.The three dismensional tests was performened to detect the AmpC enzymes in 97 intestinal Bacillus. Results The results of Cefoxitin sensitive test showed 36 strains produced AmpC enzymes. Cefoxitin sensitive test compared with three dismensional tests，the total coincidence rate was74.2 %(72 /97). The results of phenotype screening showed 15 strains produced AmpC enzymes. compared with three dismensional tests，the total coincidence rate was 91.8 %(89/97). Conclusions phenotype screening is a reliable to detect AmpC enzyme and easy to use in clinical laboratories.
　　
　　Key words:cefoxitin sensitive test; three dismensional tests; phenotype screening; AmpC enzymes
　　AmpC β内酰胺酶(简称AmpC酶)是由肠杆菌科细菌或/和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶，故AmpC酶又称作为头孢菌素酶［1，2］。随着β内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用，产AmpC酶的G-杆菌越来越多见，已逐渐引起临床医师的关注［3］。我科用头孢西丁药敏法、表型筛选法、三维试验检测97株肠道G-杆菌，加以比较，以找出一种合适临床常规应用检测AmpC酶的方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 菌株
　　从临床病人痰、血、尿、分泌物中分离的97株肠道G-杆菌株，质控菌株阴沟肠杆菌O29M和1194E从卫生部临检中心购得，分别作为AmpC酶阳性和阴性对照，大肠埃希菌ATCC25922为三维试验指示菌。
　　1.2 仪器与试剂
　　M-H琼脂、肉汤由杭州天和微生物试剂公司购得，低温冰冻离心机为德国Hettich公司生产， 型号：Zentrifugen D―78532 Tuttlingen，恒温箱，药敏纸片为OXOID公司产品。
　　1.3 头孢西丁（FOX）药敏法［4］
　　按NCCLS标准1999版操作，待测菌株对FOX耐药，视为初筛AmpC酶阳性。
　　1.4 表型筛选法［3］
　　按NCCLS标准1999版操作，用亚胺培南（IPM）、头孢吡肟（FEP）、头孢他啶/克拉维酸（CD02）、头孢噻肟/克拉维酸（CD03）、头孢噻肟（CTX）5种纸片进行筛选。判断标准：FEP、IPM表现为敏感，而CD02、CD03、CTX表现为耐药或在CD02、CD03和CTX的抑菌环内存在散在菌落判断为AmpC酶阳性；IPM表现为敏感，而FEP、CTX、CD02、CD03均耐药，提示待测菌株产AmpC酶的同时也产生其他β内酰胺酶，如产ESBLs。
　　1.5 三维试验法
　　1.5.1 酶粗提物的制备［5］
　　待测菌于肉汤中增菌，接种于M-H平板(直径为9 cm)中，置于37 ℃恒温箱内孵育24 h。刮取1/4平板的密布菌落于1 mL生理盐水中混匀。-20 ℃反复冻溶5次，每次冻的时间不少于2 h。12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液，经M-H平板上常规细菌培养阴性后于-20 ℃保存。
　　1.5.2 三维试验［6］
　　将大肠埃希菌ATCC25922制成0.5麦氏单位的菌悬液，用棉棒均匀涂布于M-H平板上，稍干后，在平板中央贴30 μg的FOX纸片，在距离纸片5 mm处向外缘方向打一长10 mm，宽1 mm的矢状槽，在槽内加30 μL粗酶提取物。置于37 ℃恒温箱内培养18～24 h。观察槽内侧端(FOX纸片的抑菌环内)周围有无细菌生长，如槽附近的抑菌圈缩小或变形均提示细菌产AmpC酶，即为三维试验阳性，如抑菌圈无丝毫变化则为三维试验阴性。
　　1.6 统计学处理
　　采用χ2检验，以P&<0.05为差异有显著性。
　　2 结 果
　　2.1 97株肠道G-杆菌都经头孢硝噻吩法检测为β内酰胺酶阳性，其中三维试验AmpC酶阳性率为155%(15/97)。

　　2.2 头孢西丁药敏法、表型筛选法与三维试验结果符合率比较 见表1。97株肠道杆菌头孢西丁药敏法结果显示产AmpC酶共有36 株，占37.1%（36 /97），与三维试验相比总符合率为74.2%，经卡方检验，差异有显著性(P&<0.05)。表型筛选法产AmpC酶的菌株有15株，占15.5%（15/97），与三维试验相比总符合率为91.8 %，差异无显著性（P&>0.05）。表1 三种AmpC酶检测法结果比较（略）
　　3 讨 论

　　1989年Bauernfeid 在汉城首次发现了质粒介导的AmpC酶。近年来世界各地陆续报道了各种型别的由染色体和持粒介导的AmpC酶。AmpC酶按其产生的方式分为3类：诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。其中持续高产酶是指菌株因为去阻遏突变，引起AmpC酶的大量表达，质粒介导的AmpC酶往往都属于此类AmpC酶［6］。目前认为很多G-杆菌如肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、铜绿假单胞菌等绝大多数均可产生低水平染色体介导的诱导型AmpC酶，因而对染色体介导的诱导型AmpC酶的检测无多大的临床意义［7］。质粒介导的持续高产型AmpC酶可见于克雷伯菌、沙门菌、大肠埃希菌等，产生这种AmpC酶的细菌具有较强的横向传播能力［8］，此种质粒同时偏码对其他抗生素的耐药性，表现为对第一代到第三代头孢菌素、头霉素、氨基糖苷类及抗假单孢菌青霉素均耐用药，但对碳青霉烯类、第四代头孢菌素和氟喹诺酮类敏感，故对此类质粒介导的持续高产型AmpC酶的检测，对于及早发现并控制耐药性的传播具有重要的意义［9］，是临床微生物实验室检测的重点。但目前尚未有一种简便、可靠的适用于临床微生物试验室常规使用的检测方法。酶提取物三维试验虽然是目前公认的质粒AmpC酶或（去阻遏）持续高产AmpC酶的经典检测方法［6］，而且有准确性高，结果清晰并且容易判读、不存在抗生素诱导等特点，但需反复冻溶菌液、操作烦琐、费时，难以在临床微生物实验室常规应用。
　　头孢西丁药敏法操作简便，但因不产AmpC酶的G-杆菌对头孢西丁也有一定的耐药率［6］，与三维试验法的总符合率仅为74.2 %（72/97），故此法仅可作为初步筛选方法；表型筛选法操作简便，快速省时，结果基本可靠，跟三维试验法有较高的符合率为 91.8 %（89 /97），与赵虎［6］等报道的符合率(89.58%)相近，且与三维法比较差异无显著性，可以作为临床常规快速检测的方法加以推广应用。
　　参考文献:
　　［1］BUSH K，JACOBY G A，Medeiros A A. A functional classification for βlactoamases and it correlation with molecular structure［J］. Antimicrob Agent Chemother，1995，39:1 211.
　　［2］赵虎，孔宪涛. AmpC酶及其耐药性［J］. 世界感染杂志，2002(2):201.
　　［3］周志慧，李兰鹃，俞云松，等，两种检测阴沟肠杆菌Ampc酶方法的比较［J］.中华检验医学杂志，2002，25:88
　　［4］夏云，赵世巧.用头孢西丁三相试验检测大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的质粒Ampc酶［J］. 重庆医科大学学报，2002，27:425.
　　［5］陈东科，张志敏，张秀珍.三维法检测β内酰胺酶的影响因素探讨及方法的改进［J］. 中华检验医学杂志，2003，26:600.
　　［6］赵虎，孔宪涛. AmpC β内酰胺酶的检测［J］. 中华检验医学杂志，2003，26:390.
　　［7］陈民均.细菌对β内酰胺药的耐药性及检测方法［J］.中华检验医学杂志，2001，24:197.
　　［8］BRADFORD P A，URBAN C.Imipenem reistance in klebsiella pmeumomiae is associated with the combination of ACT-1，a plasmid mediated AmpC βlactamse，and the loss of an outer membrane protein［J］.Antimicrobil Angents Chemother，1997，41(3):563.
　　［9］倪语星. 革兰阴性菌β-内酰胺酶的耐药性问题［J］. 中华检验医学杂志，2001，24:201.