关于SPEHPLC法测定苦丁茶老叶中熊果酸的含量

　　　　 作者：路玫，李徽，蒙大平，荣延平

【摘要】 目的 建立苦丁茶老叶中熊果酸含量的测定方法。方法 采用SPEHPLC法，以1 mL OASISR HLB Cartridge固相萃取小柱对样品进行提取分离；色谱柱为NovaPak C18 柱(3.9 mm×150 mm，4 μm)；以甲醇水磷酸（体积比85∶15∶0.1）为流动相，流速为0.8 mL·min－1，检测波长为220 nm，柱温：30 ℃。结果 测定组分熊果酸与其他组分的色谱峰达到基线分离；熊果酸平均加样回收率为98.25%，RSD＝0.64%。结论 本方法可有效减少杂质干扰，结果准确可靠，并且有利于色谱柱的保护。
【关键词】 苦丁茶；SPEHPLC法；熊果酸；含量测定
　　Abstract:Objective To establish a method for detecting the content of ursolic acid in the old leaves of Ilex Kudingcha by SPEHPLC. Methods Ursolic acid extracted from the leaves was analyzed on a NovaPak C18（3.9 mm ×150 mm，4 μm）column using methanolh3O phosphate (85∶15∶0.1) as mobile phase.The flow rate was 0.8 mL·min-1 and detection wavelength 220 nm.Results Ursolic acid could be separated well with constitutes in the leaves. The average recovery and RSDof ursolic acid were 98.25％ and 0.64%， respectively．Conclusion The method is simple and accurate.
　　Key words:Ilex Kudingcha；SPEHPLC；ursolic acid
　　苦丁茶（llex gudingcha CJ Tseng）是冬青科冬青属植物，有散风热、清头目、除烦渴的功能。在我国南部及西南部民间使用历史悠久。苦丁茶中黄酮类斛皮素和山萘素、熊果酸含量较高［1-4］。诸多文献对苦丁茶中熊果酸含量研究均是从嫩叶或成品茶中提取分离，而对其老叶中熊果酸的含量研究尚未见报道，我们采用固相萃取－高效液相色谱法对苦丁茶老叶中熊果酸的含量进行测定，为更好地开发利用苦丁茶提供依据。
　　1仪器与试药
　　1.1仪器Waters 600型四元液相色谱泵，Waters996型光电二极管阵列检测器，WatersM32色谱工作站。1 mL OASISR HLB Cartridge固相萃取小柱（WATERS公司）。
　　1.2试药熊果酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：742200111）；苦丁茶老干叶（广西天等桂仙苦丁茶有限公司，经广西壮族自治区药品检验所黄捷副主任中药师鉴定）；甲醇（色谱纯）；乙醇（分析纯）；磷酸(分析纯)，水为重蒸水。
　　2方法与结果
　　2.1色谱条件NovaPak C18 (3.9 mm×150 mm，4.0 μm)；流动相为甲醇水磷酸（体积比85∶15∶0.1）；检测波长：220 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱温：30 ℃。在此色谱条件下，熊果酸的保留时间约为13 min。
　　2.2系统适应性试验分别取熊果酸对照品溶液及样品溶液，在上述色谱条件下各进样10 μL，结果，样品溶液与对照品溶液在相同的保留时间有相似的色谱峰，而且熊果酸与其他成分能够较好地分离， 按熊果酸计算理论塔板数不低于3 000，拖尾因子1.02，分离度大于1.5，保留时间约为13 min，结果见图1。
　　2.3标准曲线的制备精密称取熊果酸对照品8.34 mg， 置10 mL容量瓶中， 用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为0.834 mg·ml-1的对照品溶液。分别取该对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mLA.熊果酸对照品； B.苦丁茶样品
　　图1高效液相色谱图　略
　　置10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，摇匀，按上述色谱条件，分别进样10 μL，以熊果酸的进样量(m)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制标准曲线，结果回归方程为：A＝220 215m-7 590.60(r＝0.999 9)，表明熊果酸的进样量在0.417-3.336 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
　　2.4精密度和稳定性试验精密吸取熊果酸对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下重复进样5次，测定峰面积，结果其峰面积的RSD＝1.34％（n＝5）。精密吸取新配制的样品溶液10 μL，每隔1 h进样测定1次，连续测定5次，结果测得峰面积的RSD＝1.82％（n＝5），说明样品溶液在5 h内稳定性良好。
　　2.5重复性试验对同一批样品（批号：041015），分别取5份，每份约10 g，按“2.7”项下操作，结果测得样品中熊果酸的平均含量为160.82 μg·g-1，RSD＝1.28%（n＝5），表明本方法的重复性良好。
　　2.6回收率试验取已测知含量的样品(批号041015)5份，每份约10 g，分别精密加入0.834 mg·mL-1的对照品溶液2.0 mL，按“2.7”项下操作，在上述色谱条件下进样10 μL，按样品含量测定方法测定，计算平均回收率，结果见表1。

转贴于 　　表1回收率试验结果　略
　　2.7含量测定称取约10 g苦丁茶老叶，剪碎，加入80％（体积分数）乙醇溶液160 mL，于85 ℃水浴回流提取2次，每次2.5 h。合并提取液，滤过，滤液于85 ℃水浴挥干，残渣以甲醇溶解并定容至10 mL，以0.45 μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液1.0 mL移入经活化的固相萃取小柱，以重蒸水2 mL、30%(体积分数)甲醇2 mL依次以3滴/s的速度进行洗脱，最后用80%（体积分数）甲醇2 mL以3滴/s的速度洗脱，收集末次洗脱液为样品溶液。将样品溶液在上述色谱条件下进样10 μL，用外标一点法计算样品中熊果酸的含量，结果见表2。
　　表2样品中熊果酸含量测定结果　略
　　3讨 论
　　3.1文献报道苦丁茶老叶所含槲皮素含量低于成品茶或嫩叶，而山萘素含量却是老叶高于嫩叶［2］。笔者试验测得苦丁茶老叶中熊果酸的含量约为嫩叶中的2倍(另文发表)，这些提示了如选用老叶作为从苦丁茶中提取熊果酸的原料，产率将比嫩叶高，苦丁茶老叶仍不失其药用价值。
　　3.2不同部位的苦丁茶叶中熊果酸的含量存在着一定差异。本文采用固相萃取高效液相色谱法测定苦丁茶老叶中熊果酸的含量，所建立的方法能较好地消除杂质的干扰，结果准确度较高。
　　3.3由于熊果酸不溶于水，在洗脱液甲醇比例研究中，发现10%～35%（体积分数）的甲醇无法将熊果酸洗脱下来， 而80%（体积分数）甲醇可以将熊果酸完全洗脱，且用量少，所以采用80%（体积分数）甲醇进行洗脱收集。
　　3.4本法简便、灵敏、准确性、重复性良好，可作为苦丁茶老叶中熊果酸含量测定的方法。
【

参考文献

】
　　［1］ 任秀莲，钟世安.苦丁茶中熊果酸的提取工艺［J］.中南大学学报：自然科学版，2004，35(1)：70-74.

　　［2］ 黄雪梅，蒙大平，荣延平.广西苦丁茶嫩叶和老叶中槲皮素和山萘素的含量测定［J］.中国现代应用药学杂志，2005，22(5)383-385.

　　［3］ 钟兆健，宋粉云.苦丁茶甲醇提取物化学成分的GCMS分析［J］.广东药学院学报，2005，21（3）：261-262.

　　［4］ 蒙大平，黄雪梅，邓玉庄.苦丁茶老叶中槲皮素和山萘素的含量测定［J］.中国医院药学杂志，2006，26(2):135-137.