作者：张红雨 费立明 王长亮
赵文华 张波 周武元 于文胜 仲伟霞 李胜
【摘要】 目的：研究胰腺癌中CXCL12-CXCR4生物学轴（CXCL12-CXCR4 biological axis）与血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）的表达情况，探讨其表达与胰腺癌的临床病理关系。方法：应用免疫组织化学和RT-PCR技术检测30例胰腺癌、癌旁、正常胰腺和胰周淋巴结组织中CXCL12、CXCR4和VEGF-C的表达情况。结果：CXCL12蛋白在胰腺癌组织中呈低表达状态，在正常胰腺组织、癌旁组织和胰周淋巴结组织均呈中等表达状态（P<0.01），RT-PCR结果也证实此结果，与胰腺癌组织中的表达相比较差异均有统计学意义（P<0.01）。CXCR4蛋白在胰腺癌组织、癌旁组织和胰周淋巴结均呈高表达状态，在正常胰腺组织中呈低表达状态，RT-PCR结果同样证实。经 Spearman检验，胰腺癌组织中CXCR4与VEGF-C蛋白的表达具有显著的相关性（P=0.038）。结论：CXCR4的表达与胰腺癌淋巴结转移密切相关，其高表达对胰腺癌中微淋巴管的生成可能起促进作用。胰腺癌组织中CXCR4与VEGF-C蛋白的表达具有显著的相关性，两者可能对胰腺癌的淋巴管生成和淋巴结转移起协同作用。
【关键词】 胰腺肿瘤·CXCL12·CXCR4·血管内皮生长因子
【ABSTRACT】 Objective: To investigate the expression of CXCL12-CXCR4 and VEGF-C in pancreatic cancer and relation to clinical pathology. Methods: The tissue samples including PAC， the cancerous peripheral tissues， the normal pancreatic tissues and peripheral lympho nodes were obtained from 30 patients with PAC. The expressions of CXCL12， CXCR4and VEGF-C proteins in these tissues were assayed by immunohistochemical staining. The expressions of CXCL12， CXCR4 and VEGF-C mRNA in PAC were also investigated by fluorescence quantitative real-time PCR. Results: In all the samples， the positive rates of CXCL12 protein in PAC， the cancerous peripheral tissues， the normal pancreatic tissues and peripheral lympho nodes were respectively 13.3％（4/30），46.7％（14/30），56.7％（17/30） and 50.0% (15/30). The positive rates of CXCR4 protein in PAC， the cancerous peripheral tissues， the normal pancreatic tissues and peripheral lympho nodes were respectively 80.0% (24/30)， 70.0% (21/30)， 26.7%(8/30) and 73.3% (22/30). The expression levels of CXCR4 mRNA in PAC tissues， the cancerous peripheral tissues and peripheral lympho nodes were higher than that in the normal pancreatic tissues (P<0.01). There was significant correlation between the expressions of CXCR4 and VEGF-C protein in PAC which was tested by Spearman correlation test (P=0.038). Conclusion: The expression of CXCR4 is significantly associated with lymphatic metastasis of PAC.There is significant correlation between the expressions of CXCR4 and VEGF-C protein in PAC. CXCR4 and VEGF-C maybe promote the development of PAC mutually.
【KEY WORDS】 Pancreatic neoplasms·Stromal cell-derived factor 1·CXC chemokine receptor 4·Vascular endothelial growth factor-C
近年来不少研究指出，趋化因子CXCL12与其特异性受体 CXCR4 所构成的 CXCL12-CXCR4生物学轴（CXCL12-CXCR4 biological axis）在多种肿瘤的播散和器官特异性转移中发挥着重要的作用。本研究对胰腺癌中CXCL12、CXCR4与血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）在胰腺癌组织中的表达情况及与其临床病理组织学的关系进行分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集山东省肿瘤防治研究院2005年1月—2007年12月外科手术治疗且临床资料完整的胰腺癌30例，其中男17例，女13例，年龄35～78岁，中位年龄57.2岁。患者知情同意后，获取胰腺癌病灶、癌旁组织（距癌2 cm以内）、正常胰腺组织和胰周淋巴结的标本。病理组织学分型：胰腺导管癌20例，乳头状腺癌10例；其中高分化癌17例，中、低分化癌13例；根据UICC胰腺癌TNM分期（1987年第4版），Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期18例。手术切除18例（Whipple术或胰体尾脾切除术），姑息性手术治疗12例（胆肠吻合术和或胃空肠吻合术），无手术死亡，所有病例术前均未行放化疗。
1.2 免疫组织化学检测 鼠抗人CXCL12、CXCR4和VEGF-C单克隆抗体购自美国ATCC公司，SP试剂盒购自福州迈新公司。已知的乳腺癌标本作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。采用免疫组织化学染色SP法。阅片由两位病理科医师分别双盲阅片，CXCL12、CXCR4和VEGF-C阳性细胞为细胞膜、细胞质或者细胞核出现棕黄色颗粒。每例切片至少计数10个400倍视野，以阳性细胞数占所有细胞的百分数分为：≤10%（-），11%～25%（+），26%～50%（++），>50%（+++）。染色强度判定：不着色（-），浅棕黄色（+），棕黄色（++），棕褐色（+++）。综合阳性细胞数和染色强度对染色结果进行分析。
1.3 RT－PCR 应用7500型RT－PCR仪（美国ABI公司制造）进行SYBRRT－PCR检测，分析CXCL12、CXCR4在胰腺癌及癌旁组织、正常胰腺组织和胰周淋巴结中的表达，以人β-actin为内参照。目的基因PCR引物序列及扩增片段长度如下：CXCL12上游：5’-CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3’，下游：5’-CTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3’，227 bp；CXCR4上游：5’-AGCTGTTGGTGAAAAGGTGGTCTATG-3’，下游：5’-GCGCTTCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3’，260 bp；β-actin上游：5’-CCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3’，下游：5’-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3’，220 bp。反应条件为95 ℃、10 s 1个循环；95 ℃、1 s，56 ℃、5 s，72 ℃、35 s共40个循环。反应结束后将检测的临界点设定在PCR扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数（threshold cycle， CT）作为模板初始浓度的间接指标，将不同浓度的标准模板拷贝的对数和相应的CT值作图，得到标准曲线。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行定性检测。
1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件对数据进行分析，采用χ2 检验，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CXCL12和CXCR4蛋白的表达情况 CXCL12在胰腺癌组织、癌旁组织、正常胰腺组织和胰周淋巴结组织中的阳性表达率分别为13.3%（4/30）、46.7%（14/30）、56.7%（17/30）和50.0%（15/30）；与胰腺癌组织相比，各组织差异均有统计学意义（P=0.011，P=0.001，P=0.006）。CXCL12蛋白在正常胰腺组织内呈中等强度表达状态，在胰腺癌组织中呈低表达或阴性表达，在癌旁组织和胰周淋巴结组织呈中等强度表达状态（图1）。CXCR4在胰腺癌组织、癌旁组织、正常胰腺组织和胰周淋巴结组织中的阳性表达率分别为80.0%（24/30）、70.0%（21/30）、26.7%（8/30）和73.3%（22/30）；与胰腺癌组织相比，癌旁组织和胰周淋巴结组织差异无统计学意义，正常胰腺组织差异有统计学意义（P＜0.01）。CXCR4蛋白在胰腺癌和癌旁组织呈高表达状态（图2）。
2.2 CXCL12、CXCR4和VEGF-C表达与胰腺癌的临床病理因素的关系 CXCL12蛋白的表达与胰腺癌的分化程度、TNM分期和淋巴结转移无明显相关性。CXCR4蛋白的表达与胰腺癌的分化程度无关，与TNM分期相关（P=0.005）。CXCR4蛋白在18例淋巴结转移阳性的胰腺癌患者均表达阳性（P=0.004），提示CXCR4的高表达与胰腺癌的淋巴结转移具有密切关系（表1）。
2.3 RT－PCR检测CXCL12和CXCR4的表达 将CXCL12、CXCR4 mRNA的拷贝数与相对应的β-actin基因的拷贝数相除进行标准化，从而得出30例标本中不同部位的CXCL12、CXCR4基因产物的平均表达量（图3）。CXCR4溶解曲线分析显示CXCR4基因PCR产物的溶解曲线峰值在86.5℃；CXCL12溶解曲线显示CXCL12基因PCR产物的溶解曲线峰值在83.5℃。
2.4 胰腺癌组织中CXCR4与VEGF-C蛋白表达的关系 经 Spearman秩相关检验，胰腺癌中CXCR4与VEGF-C蛋白的表达具有显著的相关性（P=0.038，表2），提示在胰腺癌的发展过程中CXCR4与VEGF-C的高表达具有协同促进作用。
3 讨论
2001 年 Muller 等［１］首先报告，人乳腺癌细胞系高表达趋化因子受体CXCR4及CCR7，乳腺癌原发灶也高表达CXCR4及CCR7，而在乳腺癌最常见的转移部位如淋巴结、肺、肝脏和骨髓则高水平地表达其配体CXCL12和CCL21（6Ckine）。Muller及其同事在上述开创性的研究工作中不仅验证了先前人们关于肿瘤细胞可能利用趋化因子的假说，而且揭开了趋化因子与肿瘤关系研究史上新的一页，也为阐明肿瘤转移机制和寻找抗转移新药提供了极其重要的线索。
趋化因子与其受体在肿瘤的生物学行为中表现出双向的调节作用。一方面，趋化因子能通过趋化、活化免疫细胞或抑制血管增殖而起抗肿瘤的作用；另一方面又可以通过刺激肿瘤细胞生长，趋化肿瘤细胞以及促进血管增殖和促进细胞外基质降解而达到促肿瘤生长、浸润、转移的效应。本研究采用免疫组织化学法及RT-PCR所获结果均显示胰腺癌中CXCL12呈低表达状态，其原因可能是肿瘤细胞通过某种机制抑制了CXCL12的表达，使其无法发挥抗肿瘤作用；而在癌旁组织、胰周淋巴结和正常胰腺组织中CXCL12呈中等表达状态，推测CXCL12通过趋化、活化免疫效应细胞的同时，趋化CXCR4表达阳性的肿瘤细胞向淋巴结转移，从而促进了胰腺癌的淋巴结转移，起双重调控作用。当机体免疫状态失衡、免疫力低下时，CXCL12的趋化肿瘤细胞淋巴结转移的作用逐渐占主导地位，促进了胰腺癌的侵袭与淋巴结转移。CXCR4蛋白在胰腺癌、癌旁组织以及胰周淋巴结的表达均显著增高，而CXCR4蛋白在正常胰腺组织表达却显著下降，显示CXCR4的高表达与胰腺癌的进展和淋巴结转移有密切关系，CXCR4表达阳性的胰腺癌细胞可能具有更强向淋巴结转移的能力，而这种能力是通过CXCR4的配体CXCL12的趋化作用实现的。
多项研究表明，VEGF-C、VEGF-D的表达与肿瘤的临床病理分期、组织学分化程度、可切除淋巴结中转移个数以及肿瘤预后相关［２-３］。本研究结果显示30例胰腺癌组织标本中CXCR4与VEGF-C蛋白的表达显著相关性（P=0.038），说明在胰腺癌的发展过程中CXCR4与VEGF-C的表达具有共同的促进调控作用。
本研究证实了胰腺癌进展中CXCL12及其受体CXCR4可能具有的重要作用，但仍需要通过动物实验观察CXCL12对胰腺癌病灶及转移淋巴结的治疗效果，同时积极寻找阻断CXCR4作用途径的靶点，这也将成为研究胰腺癌淋巴管生成和淋巴结转移的新热点。
参考文献
[1] Muller A， Homey B， Soto H， et al. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J]. Nature，2001， 410(6824):50-56.
[2] Hung CJ， Ginzinger DG， Zarneger R， et al. Expression of vascular endothelial growth factor C in benign and malignant thyroid tumors[J]. J Clin Endocrinol Meta， 2003，88(8):3694-3699.
[3] Neuchrist C， Erovic BM， Handisurya A， et al. Vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 3 expression in squamous cell carcinomas of the head and neck[J]. Head Neck， 2003，25(6):464-474.