限食对老龄大鼠抗衰老效应的影响

【摘要】 目的 研究限食对老龄大鼠抗衰老的生物效应，并探讨其可能机制。方法 11月龄SD大鼠68只，雌雄各半，随机分为3组，分别给予实验组大鼠按对照组食量的80%和60%，6个月后测量血清超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA），白介素2（IL2），脑组织单胺氧化酶（MAO）及肝细胞凋亡指数。结果 实验组大鼠血清SOD活性，IL2含量较对照组明显提高(P<0.05)；血清MDA水平，脑组织MAO活性，肝细胞凋亡指数较对照组显著降低(P<0.01)。结论 自老龄期开始限食，具有抗衰老的生物学效应。

【关键词】 膳食限制；衰老；肝细胞凋亡；生物学效应

　膳食限制（dietary restriction，DR），即在满足机体对各种营养素需要量的前提下， 适当限制食物的摄入，能明显延缓衰老的速度，延长实验动物的寿命。许多实验不断证实，啮齿类动物从幼年开始，每天限制正常摄食量的10%～30%，不但不会引起营养不良，还可以比正常摄食组延长10%～30%的平均和最高寿命。从成年开始限食，可以延长小鼠的最高寿限10%～20%〔1〕。对于老龄期动物的限食研究却较少有报道。本研究采用老龄期大鼠开始限食，探讨其机体内若干生物学效应的改变及可能机制，为抗衰老的研究提供新的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 分组

　　本实验采用清洁级SD大鼠，10～11月龄，由中山大学实验动物中心提供。将68只大鼠随机分为三组。对照组，自由摄食，20只，雌雄各半；限食20％组，食量摄入为对照组的80%，24只，雌雄各半；限食40％组，食量摄入为对照组的60%，24只，雌雄各半；单笼饲养6个月，至16～17月龄。动物饲养6个月后经股动脉放血处死。低温分离血清，-20℃保存，大鼠处死后在75%乙醇中浸泡3～5 min，无菌环境中取出脑组织、肝脏组织等，称重后迅速置于液氮中，后移入－80℃冰箱保存备用。

　　1.2 动物饲料

　　本实验以食物配方饲料作为动物基础饲料。每天称量对照组动物实际饲料摄入克数，并以此计算第2天实验组动物的饲料用量，调整实验组饲料中维生素和无机盐的百分含量，保证各组动物除食量摄入差异外，无机盐和维生素等微量营养素每天摄入的克数均一致。见表1。表1 大鼠食物饲料配方(略)

　　1.3 试剂

　　超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒，白介素2(IL2)检测试剂盒〔晶美生物工程（深圳）有限公司〕， 单胺氧化酶(MAO)测定试剂盒（南京建成生物工程研究所提供）；Triton X100(上海生物工程有限公司)；DAB显色试剂盒，Mayor苏木素（福州迈新生物技术开发有限公司）；细胞凋亡原位检测试剂盒（德国罗氏公司）。

　　1.4 指标测定

　　测定血清SOD，MDA，IL2；取大鼠脑组织块约0.3 g，加冷生理盐水制备成10%的组织匀浆，2 500 r/min，离心10 min。再取组织匀浆上清液加生理盐水稀释成1%组织匀浆，测定单胺氧化酶B(MAOB)。

　　1.5 细胞凋亡检测

　　取适量冷冻的肝组织，用OCT包埋，制成6 μm厚的冰冻切片，丙酮固定20 min，凋亡检测采用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）。结果判断：在光学显微镜400倍视野下，每张切片随机选择5个阳性视野，每个视野计数200个肝组织细胞中的阳性细胞核数，以平均计算阳性细胞所占百分比，求其均数值作为凋亡细胞阳性指数(AI）。

　　1.6 统计学分析

　　采用SPSS13.0软件包建立数据库，并进行统计分析。所有资料均先进行正态性检验。多组间均数比较采用单因素方差分析；各组间的两两比较采用LSD法。

　　2 结 果

　　2.1 动物的一般情况

　　实验组大鼠在初期烦躁不安，毛蓬乱少光泽，随后逐渐正常。实验组大鼠明显活泼好动，反应灵敏，对照组大鼠则显得迟钝少动，反应缓慢，缺少灵敏性。在实验期间，实验组大鼠由于限食，与初始体重比较，终末体重有不同程度的下降（P<0.05），而对照组大鼠体重明显增加，因此对照组和实验组大鼠最终体重有显著差异（P<0.01）。见表2。表2 各组大鼠初始和终末期体重变化比较(略)

　　2.2 不同组大鼠血清SOD和MDA水平变化

　　雌性大鼠各组SOD活性比较显示，限食40％和限食20％组SOD活性显著高于对照组，有统计学意义(P<0.05）；各组血清MDA含量比较显示，限食40％组和限食20％组均显著低于对照组(P<0.01，P<0.05)，且限食20％和限食40％组间血清SOD活性和MDA含量的差异亦有统计学意义（P<0.01）。

　　雄性大鼠各组SOD活性比较显示，限食40％组SOD活性显著高于对照组（P<0.01），限食20％组SOD活性也明显高于对照组，有统计学意义（P<0.05），限食20%和限食40％间血清SOD活性的差异也有统计学意义(P<0.01)；各组雄性大鼠血清MDA含量比较显示，限食40％组和限食20％组均显著低于对照组(P<0.01)。见表3。表3 各组大鼠血清SOD和MDA含量变化比较(略)

　　2.3 不同组大鼠脑组织MAOB，血清IL2含量和肝细胞凋亡指数AI比较
　　雌性大鼠脑组织MAOB活性比较显示，限食40%和限食20%组MAOB活性均显著低于对照组（P<0.01）；雄性组比较结果与雌性组相似，两个实验组MAOB活性比对照组明显降低（P<0.01）；两个实验组之间（限食40%和限食20%组）MAOB活性雄性组有统计学差异（P<0.05）。

　　各组大鼠血清IL2含量结果显示，雌性大鼠限食40％组较对照组血清IL2含量显著提高（P<0.01）；雄性鼠限食40%组IL2含量显著高于对照组（P<0.05）；限食40％组与限食20％组之间，无论是雌性或雄性大鼠，血清IL2含量的差异均有统计学差异（P<0.05）。肝细胞凋亡结果比较，雌性大鼠结果显示，随着能量限制程度的加深，凋亡指数逐渐降低，但仅限食40％组与对照组比较有统计学意义（P<0.05）；雄鼠的结果与雌鼠类似，限食40％组与对照组比较有统计学差异（P<0.05）；限食40％组与限食20％组之间，无论是雌性或雄性大鼠，肝细胞凋亡指数均有统计学差异（P<0.05）。见表4。表4 不同组大鼠脑组织MAOB、血清IL2含量和肝细胞凋亡指数AI比较(略)

　　2.4 肝细胞形态学变化

　　光学显微镜下可见正常肝细胞核呈蓝色，凋亡细胞的染色特征为，阳性细胞细胞核染色呈棕褐色，细胞变小发生皱缩，核质浓缩，凋亡小体形成。老年对照组可见TUNEL 阳性的肝细胞，而限食组凋亡细胞较少。见图1。

　　3 讨 论

　　营养物质缺乏、营养过剩和营养素之间的比例失调，都可能加速机体的衰老〔2〕。膳食为机体维持生命活动所必需，但能量的摄入应限制在一定的水平上，对于老年个体也应如此。

　　随着增龄，抗氧化酶的活性减低，机体清除自由基的能力减弱，使自由基的产生过多或清除障碍，机体内氧化抗氧化的平衡状态被打破，引起正常细胞功能的退化，是促使机体衰老的重要原因〔3〕。SOD是生物体内氧自由基清除系统的重要酶系，MDA是自由基代谢的最终产物。在限食20%和40%两种剂量效应下，血清SOD活性均明显高于老年对照组，血清MDA含量均显著低于老年对照组。与国外Yu等〔4〕的研究结果一致，表明限食可以提高机体内抗氧化酶的活性，增强机体清除自由基的能力。

　　研究认为，老年脑组织是体内氧负荷最大的器官之一，是与衰老相关性很高的组织。近来研究发现，MAO的活性与机体的衰老有密切关系。已有实验结果表明〔5〕，MAOB在代谢过程中产生的自由基可以导致神经元的损伤，从而引起神经系统生理功能失调，细胞老化，机体衰老及老年性疾病的发生。本研究结果显示，限食可以下调脑组织内MAOB活性随增龄的升高。国外的研究结果也证明〔6〕，限制能量的摄入可以提高脑组织内多巴胺、去甲肾上腺素、5羟色胺的水平，抑制MAO催化的氧化去氨基作用。

　　IL2、IL3 等细胞因子的分泌随年龄增长持续下降。T细胞的克隆扩增主要为IL2所介导，IL2合成不足或不能与IL2受体结合都可抑制T细胞的增殖，同时影响B细胞、细胞毒性T细胞、NK细胞等其他免疫细胞的生长和功能改变〔7〕。本研究显示，限制能量摄入40%时，可显著提高血清中IL2的含量，Pahlavani〔8〕的研究结果发现，限食可增强大鼠淋巴细胞的增殖反应，增加IL2基因在转录水平上的表达，表明了限制能量摄入能增强实验动物的免疫功能。

　　目前，对于细胞凋亡和衰老的相关性研究表明，细胞凋亡通过破坏重要的不可替代的细胞对衰老起负面影响，老年肝的储备能力降低，肝的生物转化能力降低，血浆白蛋白明显减少等变化，均与老年肝组织细胞数目的减少有关〔9〕。本研究结果显示出，老龄大鼠体内肝细胞的凋亡增多，而限食组的大鼠肝细胞凋亡明显减少。Higami等〔10〕的研究结果同样显示限食可抑制肝细胞的凋亡。

　　膳食限制对于老年机体衰老的影响几乎涉及了许多组织结构和生理功能的改变。老年期限食也可延缓或逆转大部分随增龄发生的生理与病理变化趋势，可作为老年期延缓衰老的一种有效方法。

参考文献

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　　4 Yu BP.Aging and oxidative stress：modulation by dietary restriction〔J〕. Free Radic Biol Med，1996；21(5):65168.

　　5 Shemyakov SE.Monoamine oxidase activity，lipid peroxidation，and morphological changes in human hypothalamus during aging〔J〕.Bull Exp Biol Med，2001；131(6):5868.

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　　7 陈智松，吴志奎，王 蕾，等.枸杞多糖对衰老小鼠IL2、IL2R的效应〔J〕.中国免疫学杂志，2001；17(6)：3123.

　　8 Pahlavani MA.Influence of caloric restriction on aging immune system〔J〕. J Nutr Health Aging，2004；8(1):3847.

　　9 Warner HR，Hodes RJ，Pocinki K.What does cell death have to do with aging〔J〕.J Am Geriatr Soc，1997；45(9):11406.

　　10 Higami Y，Shimokawa I，Tomita M，et al.Aging accelerates but lifelong dietary restriction suppresses apoptosisrelated Fas expression on hepatocytes〔J〕.Am J Pathol，1997；151(3):65963.