硼替佐米诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的机制

　　　　 作者：马宁 刘子玲 马克威 赵殿凤 张永峰

【摘要】 目的 探讨硼替佐米诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的机制。方法 采用MTT法检测硼替佐米对SKOV3细胞的细胞生长抑制率，免疫组化法及Western印迹法检测bcl2、bad蛋白表达的变化。结果 硼替佐米明显抑制SKOV3细胞的增殖，48 h后随着作用时间的延长和药物浓度的升高，抑制作用越来越明显，呈明显的时间剂量依赖关系(P＜0.05)。硼替佐米能够有效降低抗凋亡蛋白bcl2的表达和增加促凋亡蛋白bad的表达。结论 硼替佐米能够有效抑制SKOV3细胞的增殖；可能通过减少bcl2蛋白和增加bad蛋白的表达来诱导细胞凋亡。

【关键词】 硼替佐米；凋亡；卵巢癌

卵巢癌发病率在妇科恶性肿瘤中占第3位，死亡率占妇科恶性肿瘤的首位。虽然卵巢癌的治疗取得了较大进展，但5年生存率仍无明显改善。靶向治疗已成为妇科恶性肿瘤未来治疗的趋势，而肿瘤特异性靶点则是靶向治疗成败的关键。目前蛋白酶体抑制剂硼替佐米是针对肿瘤进行靶向治疗最有应用前景的药物之一〔1，2〕。本文通过研究硼替佐米对卵巢癌SKOV3细胞生长、凋亡相关蛋白的影响，探讨硼替佐米诱导SKOV3细胞凋亡的作用机制，为卵巢癌的治疗寻找新途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株及细胞培养

　　人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV3细胞为本研究室传代保存的细胞系，在5% CO2，饱和湿度的37℃培养箱培养，培养基为含10%热灭活胎牛血清的IMDM培养液（内含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素）。

　　1.2 药物及试剂

　　硼替佐米（西安杨森公司惠赠），IMDM培养基（GIBCOBRL公司），胎牛血清(杭州四季青生物材料工程公司)，噻唑兰（MTT，华美生物工程公司），胰蛋白酶（北京鼎国生物技术有限公司），鼠抗人bcl2蛋白单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人bad蛋白单克隆抗体（武汉博士德生物公司），DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）。

　　1.3 MTT法检测细胞生长抑制率

　　取对数生长期的SKOV3细胞〔(1～5）×105/ml〕接种在96孔板内，孵育过夜后，实验组分别给予终浓度为0.05、0.125、0.25、0.5、1.0、5.0 μmol/L的硼替佐米，对照组给予相同体积的0.9%生理盐水，每组设3个复孔。置37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24、48、72 h，然后MTT染色并用自动酶标仪490 nm处测定光吸收度。取3孔平均值计算细胞生长率和抑制率：生长率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%；细胞生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。根据细胞生长抑制率绘制细胞生长抑制曲线，选择干预浓度。每组实验均重复3次。

　　1.4 免疫组化法检测细胞内bcl2和bad蛋白表达

　　采用SP法，具体步骤按试剂盒说明进行。胞浆染为黄色或黄棕色，且染色强度明显高于背景者为阳性细胞。综合染色强度和分布范围进行半定量处理，（）为高表达，（+）、（）均为低表达。

　　1.5 Western印迹法测定bcl2、bad蛋白表达

　　全细胞裂解液加入等体积的含2巯基乙醇(1 mmol/L)的2×SDS样品缓冲液并煮沸5 min。样品在12%～15%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳(蛋白电泳上样量相当于5×105细胞/道)。电泳完成后，经4℃、14 V过夜或室温、50 V、1 h将蛋白从胶上转印到0.2 μm的硝酸纤维素滤膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h。TBS浸洗后加入一抗(bcl2单克隆抗体/bad单克隆抗体)在室温下孵育1～2 h。再用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(稀释度为1∶1 000)室温孵育1 h，加显色液显色2～3 min，观察结果。图像分析系统进行计算机图像分析。

　　1.6 统计学分析

　　采用SPSS 13.0统计软件。计量资料用方差分析，数值以x±s表达，进行正态分布检验；计数资料采用成组设计两样本比较（MannWhitney Test）秩和检验。

　　2 结 果

　　2.1 硼替佐米对SKOV3细胞的生长抑制作用

　　见图1。24 h内随着药物浓度的增加，对SKOV3细胞的增殖无明显抑制作用（P＞0.05）；48 h后，随着作用时间的延长和药物浓度的升高，抑制作用越来越明显，呈明显的时间剂量依赖关系(P＜0.05)。因在0.5 μmol/L浓度时，随着作用时间的延长，硼替佐米对细胞的生长抑制作用相对最为显著，故选择此浓度为干预浓度。

　　2.2 免疫组化法检测bcl2和bad蛋白的表达

　　bcl2蛋白均主要分布在细胞浆中，呈棕黄色。对照组细胞浆内可见深棕褐色颗粒，表达呈强阳性；48 h组细胞浆内可见棕色颗粒，表达呈阳性； 72 h组细胞浆内可见淡棕色颗粒，表达呈弱阳性(见图2)。随着作用时间的延长和药物浓度的升高，硼替佐米能够有效降低抗凋亡蛋白bcl2的表达。bad蛋白主要以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。对照组细胞浆内无棕褐色颗粒，表达呈阴性；48 h组细胞浆内可见棕色颗粒，表达呈阳性； 72 h组细胞浆内可见深棕色颗粒，表达呈强阳性（见图3）。随着作用时间的延长和药物浓度的升高，硼替佐米能够有效增加促凋亡蛋白bad的表达。

　　3 讨 论

　　硼替佐米是一种对26S蛋白酶体具有高度特异性抑制能力的二肽基硼酸化合物，通过抑制蛋白酶体20S催化中心的活性，选择性抑制体内某些具有重要调控作用的蛋白质降解，进一步使细胞分裂停止在G2M期，导致细胞发生凋亡〔3～5〕。

　　卵巢癌的传统治疗手段缺乏肿瘤组织特异性，靶向治疗已成为当今卵巢癌治疗的新趋势。本研究表明硼替佐米能够有效抑制卵巢癌细胞的生长，这为卵巢癌治疗开辟新的治疗方法指明了方向。目前研究已经表明：PI3K/AKT通路中的组成成分在卵巢癌中异常表达，某些组分的功能缺失导致模式生物肿瘤的转化，以PI3K/AKT途径为靶标的基因治疗途径在不断的发展。bcl2蛋白和bad蛋白均为PI3K/AKT信号传导通路的下游基因，通过AKT蛋白的变化来调节这两种蛋白的表达，从而调节细胞凋亡过程。本实验发现硼替佐米能够有效降低抗凋亡蛋白bcl2的表达和增加促凋亡蛋白bad的表达。有研究认为AKT信号通路下游区的NFκB的激活受到限制性抑制因子IκB的密切控制，IκB是通过26S蛋白酶体的降解来依次调节的〔6〕。在小细胞肺癌（SCLC）中，硼替佐米通过抑制NFκB激活，从而降低了bcl2水平。本实验中，硼替佐米作用于卵巢癌细胞后，bcl2表达水平降低，与上述研究结果一致。但硼替佐米是否能够作为单一因素在临床中应用，仍需要在以后的临床实验中加以证明。尽管笔者不能证明PI3K/AKT信号途径就是硼替佐米作用于卵巢癌的必然机制，但是bcl2和bad蛋白均为PI3K/AKT信号传导通路的下游基因，AKT蛋白的变化可以调节这两种蛋白的表达，从而启动细胞凋亡过程，所以推测硼替佐米通过减少bcl2蛋白和增加bad蛋白的表达，激活PI3K/AKT途径启动凋亡信号通路诱导细胞死亡；同时也可能与PI3K/AKT通路中的组成成分在卵巢癌中异常表达，某些组分的功能缺失导致模式生物肿瘤的转化相关。这将为治疗卵巢癌寻找新的生物学靶点提供理论依据。

　　有学者认为bcl2的过度表达是一个可靠的临床预后好的指标〔7〕，Kohler 等〔8〕也发现，bax和bad的高表达与急性白血病的预后不良相关，可以作为一个预后指标。故此，如果能够通过检测bcl2和bad蛋白表达水平来进一步评价肿瘤的治疗及预后，将为实体瘤的治疗提供临床指导。

参考文献

　1 Lenz H.Clinical update:proteasome inhibitors in solid tumors〔J〕.Cancer Treat Rev，2003;29(1):418.

　　2 Cusack JC，Rong L，Houston M，et al.ECPTll with proteasome inhibitor PS341:implications for systemic nuclear factorκB inhibition〔J〕.Cancer Res，2001;61:353540.

　　3 Julian A.Development of the proteasome inhibitor PS341〔J〕. Oncologist，2002;7:916.

　　4 LeBlanc R，Catley LP，Hideshima T，et al.Proteasome inhibitor PS341 inhibits human myeloma cell growth in vivo and prolongs survival in a murine model〔J〕.Cancer Res，2002；62(17):49965000.

　　5 李 明，缪泽鸿，丁 健.蛋白酶体及其抑制剂的研究进展〔J〕.中国药理学通报，2008；24(5):5659.

　　6 Mortenson MM，Schlieman MG，Virudachalam S，et al.Reduction in bcl2 levels by 26S proteasome inhibition with bortezomib is associated with induction of apoptosis in small cell lung cancer〔J〕.Lung cancer，2005；49(2):16370.

　　7 Tanaka K，Iwamoto S，Gon G，et al.Expression of surviving and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，2000；6:127.

　　8 Kohler T，Schill C，De Ininger MW，et al.High bad and bax mRNA expression correlate with negative outcome in acute myeloid leukemia (AML)〔J〕.Leukemia，2002;16(1):22.