外周血MSCs的分离培养及对GCSF的动员反应

　　　　 作者：邓均，邹仲敏，张春雷，王军平，艾国平，粟永萍

【摘要】 目的 建立多种种属外周血间充质干细胞（MSCs）的分离培养方法，探讨其对粒细胞集落刺激因子（GCSF）的动员反应。方法 用percoll（1.131 g/mL）分离多种种属外周血单个核细胞，进行贴壁培养MSCs。以GCSF作为动员剂，培养骨髓和外周血来源的MSCs，计数动员前后的成纤维细胞集落形成单位（CFUF）。结果 对多种种属进行外周血MSCs分离培养，成功率不同。在本实验条件下，可以稳定的直接分离培养出大鼠外周血的MSCs。GCSF动员后，骨髓来源MSCs的CFUF数量显著高于对照组（P＜0.01）；外周血来源MSCs的CFUF数量也显著高于对照组（P＜0.01），接近4倍。结论 不同种属外周血MSCs分离培养难易不同，其直接原因是生理条件下外周血中存在的MSCs量少导致的。GCSF可以有效地动员大鼠骨髓和外周血MSCs。

【关键词】 间充质干细胞；动员；粒细胞集落刺激因子；细胞培养

　　Abstract: Objective To establish the isolating cultural method of MSCs from some genus peripheral blood (PB)， and explore the mobilization response of MSCs by GCSF. Methods MSCs from some genus PB were isolated by percoll (1.131 g/mL) and carried out adherent culture. MSCsderived bone marrow and PB were cultured and its CFUF were counted after mobilization by GCSF. Results PB MSCs were isolated and cultureed successfully or unsuccessfully from different genus. Under our experiment condition， rat’s PB MSCs could been isolated and cultured steadily. A significantly higher number of CFUF of BMderived MSCs and PBderived MSCs than that of control group after mobilization by GCSF（P＜0.01），almost 4fold increase. Conclusion PB MSCs were isolated and cultured successfully or unsuccessfully from different genus， it concerned with a small number of circulating MSCs in BP. We confirmed that GCSF mobilized BMderived MSCs， especially PBderived MSCs by CFUF assay.

　　Keywords: mesenchymal stem cell; mobilization; GCSF; cell culture

　　正常生理情况下，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）大量存在于骨髓，循环血液中仅有少量。已有研究证实可从胎儿和新生儿血液中分离培养出循环MSCs［1］。但从成熟个体外周血中分离MSCs，因受实验人员、环境、方法等影响，有成功［2］也有失败的［3］。对不同种属动物(或人)的外周血MSCs进行分离培养，其结果也不一样。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，GCSF)作为体内重要的调节因子，自GCSF分子克隆和基因合成成功以来，在临床上已广泛应用。而GCSF大量应用于白血病的临床治疗，主要得益于其对造血干细胞的有效动员。那么除了动员造血干细胞外，GCSF能否动员骨髓细胞中的MSCs或其他干细胞，还存在着很大争议［4］。因此，本研究对不同种属的外周血MSCs进行分离培养，在本实验室条件下建立成熟的分离培养外周血MSCs的方法，并探讨GCSF能否有效动员外周血MSCs。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及主要试剂

　　2月龄的健康清洁SD大鼠，体重100～150 g，雌雄不拘。健康C57BL/6小鼠，雌雄不拘，SPF级，6周龄，体重20～25 g。健康日本大耳白兔。动物均由本校实验动物中心提供。MEM/F12培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），GCSF（齐鲁制药有限公司）。

　　1.2 外周血MSCs的直接分离和培养

　　1.2.1 实验标本　　为了探讨在本实验条件下，能否直接从外周血中分离培养出MSCs，拟对小鼠、大鼠、兔、人的外周血进行MSCs分离培养。标本分别为：①C57BL/6小鼠4只；②SD大鼠4只；③日本大耳白兔外周血4份；④人(志愿者)外周血4份。小鼠和大鼠外周血标本通过剪开的股动脉采集，用肝素化管分别收集0.8 mL和5 mL外周血；兔外周血标本为股动脉处抽取5 mL血液；人外周血标本为肘部静脉抽取5 mL血液。

　　1.2.2 细胞分离和培养　　分别将各外周血标本用percoll（1.131 g/mL）分离单个核细胞，制成细胞悬液，计数后以6×105 /cm2密度接种于培养瓶，置于5% CO2、37 ℃孵箱。48 h后全量换液，去除悬浮细胞，以后3～4 d半量换液。细胞达80%～90%融合后，用0.25%胰酶消化传代。

　　1.3 GCSF对大鼠MSCs的动员效应

　　1.3.1 实验分组　　2月龄的8只SD大鼠分为2组。正常对照组（BMN表示骨髓源MSCs对照组，PBN表示外周血MSCs对照组）：4只大鼠连续5 d尾静脉注射0.9% NaCl 0.5 mL。GCSF动员组（BMG表示骨髓源MSCs的GCSF动员组，PBG表示外周血MSCs的GCSF动员组）：4只大鼠连续5 d尾静脉注射GCSF（20 μg·d-1·kg-1）0.5 mL。

　　1.3.2 外周血和骨髓样本的收集培养　　对照组和GCSF动

　　a:大鼠外周血MSCs；b:人外周血MSCs

　　图1 直接分离、培养外周血MSCs(×100)员组5 d后收集骨髓样本，获取MSCs。具体操作为，游离股骨，清除股骨周围软组织，离断股骨头。用DMEM/F12（含20%胎牛血清）培养基冲洗股骨头断端，制成细胞悬液，计数后以5×105 /cm2密度接种于培养瓶，置于5% CO2、37 ℃孵箱。48 h后全量换液，去除悬浮细胞，以后3～4 d半量换液。细胞达80%～90%融合后，用0.25%胰酶消化传代。外周血样本的收集：剪开大鼠股动脉，用肝素化管收集5 mL外周血。用percoll（1.131 g/mL）分离单个核细胞，制成细胞悬液，计数后以6×105 /cm2密度接种于培养瓶，以后方法同骨髓MSCs的培养。

　　1.4 成纤维细胞集落形成单位(CFUF)分析

　　细胞消化后(第一代)以105总量接种于25 cm2的培养瓶，培养液为含15%胎牛血清的DMEM/F12，置入5% CO2、37 ℃孵箱。48 h后全量换液，7 d后，计数成纤维细胞集落形

　　a:骨髓MSCs对照组；b:骨髓MSCs的GCSF动员组；c:外周血MSCs的GCSF动员组

　　图2 大鼠骨髓和外周血第一代MSCs的集落形成(×100)

　　a:总数为105骨髓来源细胞中的CFUF数量；b:总数为105外周血来源细胞中的CFUF数量；*:与BMN比较，P＜0.01；＃:与PBN比较，P＜0.01

　　图3 骨髓和外周血MSCs的CFUF分析

　　成单位（CFUF），每细胞集落形成单位含50个以上细胞。

　　2 结果

　　2.1 外周血MSCs的直接分离和培养结果

　　小鼠外周血标本血量太少，培养48 h换液后，只有少数几个散在细胞贴壁，且不能呈梭形生长，培养一段时间后逐渐死亡。大鼠外周血标本均能培养出MSCs（图1a）。兔外周血标本全部不能培养出MSCs。人外周血标本有两份标本能培养出MSCs（图1b）。

　　2.2 GCSF对大鼠MSCs的动员效应

　　成功培养出大鼠外周血来源和骨髓来源的MSCs。观察细胞集落的形成（图2），进行CFUF分析。结果显示GCSF动员后，骨髓来源MSCs的CFUF数量显著高于对照组（P＜0.01）。BMN、BMG的CFUF值（±s，n=4）分别为29.50±3.87、49.75±4.57。同样，经GCSF动员后外周血来源MSCs的CFUF数量也显著高于对照组（P＜0.01）。PBN、PBG的CFUF值（±s，n=4）分别为7.25±1.26、24.75±2.63，PBG较PBN增高接近4倍（图3）。

　　3 讨论

　　近年来，干细胞由于多向分化的潜能而越来越受到重视，也成为细胞工程、再生医学中的主要选择细胞［5］。现今MSCs主要是从骨髓中获取，能否从成体外周血中分离和培养出MSCs还没有定论［23］。在不同的实验条件下，从外周血中分离和培养MSCs的结果也不一样。为了探讨在本实验条件下，能否直接从外周血中分离培养出MSCs，本研究对小鼠、大鼠、兔、人的外周血进行MSCs分离培养。结果表明即使在同样实验条件下，分离培养不同种属MSCs的成功率也不一样。研究显示，在培养骨髓原代MSCs时，需要接种合适的细胞量，细胞太少会减少细胞间的联系和支持，从而导致MSCs的滞长。在外周血MSCs培养过程中，本研究发现细胞培养后24～48 h内，贴壁细胞多的可以培养成功，而贴壁细胞少的则很难培养成功。本文认为动物和人的外周血中都存在MSCs，但外周血中的MSCs量少直接导致了对其分离培养的困难，如小鼠的血液能取出的量不过1 mL，所以很难培养出外周血MSCs。本实验显示在本实验条件下，能稳定地分离培养出大鼠外周血MSCs，故以大鼠为实验模型，研究动员后外周血MSCs的细胞特性较可靠。

　　循环血中虽然存在MSCs，但要达到细胞治疗的目的，还必须利用外来因素刺激动员骨髓内的MSCs，使其大量释放进入循环血。研究显示，GCSF是造血干细胞的有效动员剂，但对于其他干细胞如MSCs的动员、循环，却存在着争议。CFUF被认为是比较成熟的MSCs后代和间质的前体细胞，CFUF分析可用来评估培养体系中MSCs的数量。在本实验中通过CFUF分析，证实GCSF能有效动员骨髓和外周血中的MSCs，尤其是对外周血中的MSCs动员更明显。可见经GCSF动员5 d后，骨髓内MSCs的大量增加，可能与在壁龛（niche）内处于静止的MSCs被激活增生有关。由于正常条件下骨髓内MSCs的量远远大于外周血中的MSCs，经GCSF动员使骨髓MSCs释放到外周血，就会导致外周血中MSCs增加量相对很高。

参考文献

［1］ Lee MW， Choi J， Yang MS， et al. Mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cord blood［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2004，320(1):273-278.

［2］ Porada CD， Zanjani ED， Almeida Porad G. Adult mesenchymal stem cells: a pluripotent population with multiple applications［J］. Curr Stem Cell Res Ther， 2006，1(3):365-369.

［3］ Pountos I， Corscadden D， Emery P， et al. Mesenchymal stem cell tissue engineering: techniques for isolation， expansion and application［J］. Injury， 2007，38(Suppl 4):S23-S33.

［4］ Zvaifler NJ， Marinova Mutafchieva L， Adams G， et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal inpiduals［J］. Arthritis Res， 2000，2(6):477-488.

［5］ Chan BP， Hui TY， Yeung CW， et al. Selfassembled collagenhuman mesenchymal stem cell microspheres for regenerative medicine［J］. Biomaterials， 2007，28(31):4652-4666.