作者：甘宜敏，孔凡运，史震，汤仁仙，郑葵阳
【摘要】 目的 克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G(apolipoprotein B mRNA editing enzyme，catalytic polypeptide 3G，APOBEC3G)基因cDNA，构建APOBEC3G基因的真核表达载体，并在体外进行表达和鉴定。方法 采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因，将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体，构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒，并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞，经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果 双酶切鉴定和测序结果表明，APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示，转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达，转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论 成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G，为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。
【关键词】 APOBEC3G;克隆;真核表达载体
Abstract： Objective To clone the cDNA of human apolipoprotein B mRNA editing enzyme， catalytic polypeptide-like 3G (APOBEC3G) gene and construct the eukaryotic expression vector for the in vitro expression and identification. Methods The coding region of APOBEC3G gene was amplified by RT-PCR from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy humans， and then the gene fragment was inserted into the recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1 to construct the eukaryotic expression plasmid of pcDNA3.1-A3G， which was transfected into HepG2 and HL7702 cells， respectively. The expressed products in the HepG2 and HL7702 cells were detected by immunocytochemistry and Western blot. Results The results of double enzyme digestion and sequencing showed that the pcDNA3.1-A3G-transfected HepG2 and HL7702 cells were both highly expressed， while the cells transfected with the blank plasmid pcDNA3.1 and those untransfected cells were low expressed or unexpressed. Conclusion The eukaryotic expression vector of human APOBEC3G， i.e.， pcDNA3.1-A3G was successfully constructed， which lays an experimental basis for the study of APOBEC3G against HBV.
Key words： APOBEC3G; clone; eukaryotic expression vector
人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G(APOBEC3G)[1]是在研究HIV时发现的一种RNA/DNA编辑酶，具有胞嘧啶脱氨酶活性，可使胞嘧啶(C)脱氨基变为尿嘧啶(U)，从而诱导病毒基因组发生碱基突变。其可抑制病毒感染因子(virion infectivity factor， vif)缺陷性(△vif)HIV-1在非允许细胞(如巨噬细胞、Hut 68和人T淋巴瘤细胞系CEM等)内的复制，成为近年来逆转录病毒研究领域的一项重大进展。HBV虽不属于逆转录病毒，但其有一个与HIV类似的逆转录复制过程。有研究表明APOBEC3G可抑制HBV复制[2-3]，但具体机制不明确。本实验从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因，并构建该基因的真核表达载体，为后续研究APOBEC3G抑制HBV复制的作用机制奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、细胞株 pcDNA3.1质粒、HepG2细胞和HL7702细胞由本室保存。
1.1.2 主要试剂及引物 RPMI-1640培养粉、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，PCR试剂盒(Promega公司)，限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ(Takara公司)，兔抗人APOBEC3G多克隆抗体(AVIVA公司)，PCR引物及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
1.1.3 仪器 CO2恒温培养箱、高速冷冻离心机、PCR扩增仪、Biophotometer生物分光光度计(Eppendorf公司)，凝胶成像系统(BIO-RAD公司)。
1.2 方法
1.2.1 APOBEC3G的克隆、真核表达载体构建及鉴定 抽取健康人外周血，分离收集单个核细胞(PBMCs)，Trizol法提取RNA。RT-PCR扩增获得约1.2 kb大小的含APOBEC3G全基因编码序列的DNA片段。逆转录反应体系为25 μl，混匀后置42℃孵育1 h。以逆转录产物2 μl为模板进行PCR扩增。上游引物序列：5′-CCCAAGCTTATGAAGCCTCACTTCAGAAAC-3′，下游引物序列：5′-CCGGAATTCTCAGTTTTCCTGATTCTGGAG-3′。上、下游引物序列5′端分别带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点。PCR循环参数：95℃ 5 min预变性;随后95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，共35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物纯化后用HindⅢ和EcoRⅠ酶切、回收并连接到pcDNA3.1载体上，转化、扩增、筛选并经酶切鉴定，获得APOBEC3G真核表达质粒pcDNA3.1-A3G，并经测序确证。
1.2.2 RT-PCR鉴定APOBEC3G的真核表达 人肝癌细胞HepG2用含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液常规培养。人正常肝细胞HL7702用含20%小牛血清，其他成分同HepG2细胞的培养液培养。接种6孔板后，用Lipofectamin 2000分别将质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-A3G转染HepG2细胞，以未转染细胞做空白对照，同法转染HL7702细胞，操作按试剂说明书进行。转染72 h后收集细胞，提取总RNA，进行RT-PCR。
1.2.3 免疫细胞化学鉴定APOBEC3G的真核表达 细胞常规培养，接种24孔板后，转染方法同上，操作按试剂说明书进行。转染72 h后，PBS洗涤细胞，免疫细胞化学法检测转染细胞胞质中目的蛋白：经4%多聚甲醛固定和0.1%TritonX-100通透细胞膜后，依次加入一抗和二抗，加NBT/BCIP显色液显色后于光镜下观察，并照相。
1.2.4 Western blot鉴定APOBEC3G真核表达 细胞常规在培养瓶中培养，转染方法同上，操作按试剂说明书进行。转染72 h后收集细胞蛋白，进行SDS-PAGE电泳和蛋白印迹分析鉴定。
2 结 果
2.1 RT-PCR扩增APOBEC3G cDNA 从外周血单个核细胞提取总RNA，经特异性引物扩增后行琼脂糖凝胶电泳。结果(图1)可以看出，在约1.2 kb处有一明显条带，与预期的APOBEC3G基因片段相符。
图1 RT-PCR扩增人APOBEC3G cDNA
M:DNA Ladder;1， 2:RT-PCR扩增产物
2.2 真核表达载体pcDNA3.1-A3G的构建与鉴定 将上述PCR回收产物用HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶消化后与用同样酶切的线状载体pcDNA3.1相连，使之插入到多克隆位点HindⅢ和EcoRⅠ之间，构建重组表达质粒pcDNA3.1-A3G。重组质粒pcDNA3.1-A3G酶切产物的电泳结果见图2。
图2 重组质粒pcDNA3.1-A3G的酶切鉴定
M:DNA Ladder;1:pcDNA3.1-A3G/HindⅢ+EcoRⅠ;2:pcDNA3.1-A3G 可以看出，将重组质粒pcDNA3.1-A3G用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，得到大小约1.2 kb的片段，大小与理论值相符，表明目的片段被连接到载体中。为进一步确认，对重组质粒pcDNA3.1-A3G进行了DNA序列测定，测序结果证实APOBEC3G基因序列与GenBank公布一致。
2.3 重组质粒pcDNA3.1-A3G转染细胞表达产物的鉴定
2.3.1 重组质粒转染细胞中A3G mRNA的RT-PCR结果 RT-PCR结果(图3)可以看到，转染pcDNA3.1-A3G的HepG2细胞较转染pcDNA3.1和未转染的HepG2细胞目的基因条带亮，提示在转染重组质粒的HepG2细胞中，APOBEC3G基因高表达。转染重组质粒的HL7702细胞亦可见目的基因表达，而转染空载质粒和未转染的细胞未见目的条带表达，表明重组质粒在HL7702细胞中获得表达。
图3 RT-PCR检测转染细胞A3G mRNA表达
A.HepG2细胞RT-PCR后跑琼脂糖凝胶电泳示A3G mRNA表达(M:DNA Ladder，1:转pcDNA3.1-A3G，2:转pcDNA3.1，3:未转染);B.HL7702细胞A3G mRNA表达(M:Marker，1:转pcDNA3.1-A3G，2:转pcDNA3.1，3:未转染);β-actin为内参
2.3.2 免疫细胞化学鉴定 为进一步直观分析目的分子的表达，本实验以转染空载质粒pcDNA3.1细胞为阴性对照，以未转染细胞为空白对照进行免疫细胞化学鉴定，结果显示(图4)，转染pcDNA3.1-A3G的细胞比未转染和转染空载质粒pcDNA3.1的细胞染色深，提示蛋白表达量前者较后二者增高。
图4 HepG2和HL7702细胞免疫细胞化学(×200)
A、B、C示HepG2细胞免疫细胞化学结果(A:未转染，B:转pcDNA3.1，C:转pcDNA3.1-A3G);D、E、F示HL7702细胞免疫细胞化学结果(D:未转染，E:转pcDNA3.1，F:转pcDNA3.1-A3G)2.3.3 重组质粒转染细胞的Western blot结果 重组质粒转染后，提取蛋白进行Western blot检测，结果表明(图5)，转染pcDNA3.1-A3G的HepG2细胞较转染空载质粒和未转染的HepG2细胞目的蛋白高表达;转染重组质粒的HL7702细胞有目的蛋白表达，而转染空载质粒和未转染的HL7702细胞未见目的蛋白表达。此结果与RT-PCR结果相符。
3 讨 论
人类APOBEC3G基因位于人的第22号染色体长臂(22q13.1-q13.2)上，含有8个外显子和7个内含子，cDNA长度为1 155 bp，编码384个氨基酸，是载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(APOBEC)家族的一员，主要在人外周血单个核细胞、脾细胞、卵巢和睾丸等细胞或组织表达。已有大量的研究结果表明，APOBEC3G能显著抑制HIV的复制[4-5]。
目前慢性乙型肝炎的治疗药物主要是干扰素和核苷类似物，但由于治疗副作用和病毒耐药等原因，治疗效果不理想。因此寻找新的抗病毒药物势在必行。HBV有一个与HIV相似的逆转录过程，据此推测APOBEC3G可以抑制HBV的复制。2004年，Turelli等[2]在《Science》上发表文章首次证实了APOBEC3G对HBV具有强烈抑制作用。大量研究证实了APOBEC3G对HBV的抑制作用[6]，但其作用机制尚不清楚。
本研究目的在于克隆APOBEC3G的cDNA及构建APOBEC3G cDNA真核表达载体，为研究APOBEC3G抑制HBV的机制提供基因来源和技术手段。因此根据GenBank中APOBEC3G cDNA 序列设计了上下游引物，进行RT-PCR ，并成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-A3G，将此质粒转染HepG2和HL7702细胞，经RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot分析鉴定，此蛋白表达载体可在真核细胞中表达，为下一步应用该载体探究APOBEC3G蛋白对HBV抑制作用的机制提供实验基础。
参考文献
[1] Sheehy AM， Gaddis NC， Choi JD， et al. Isolation of a human gene that inhibits HIV-1 infection and is suppressed by the viral Vif protein [J].Nature，2002， 418(6898):646-650.
[2] Turelli P， Mangeat B， Tost S， et al. Inhibition of hepatitis B virus replication by APOBEC3G [J].Science，2004，303(5665):1829.
[3] Nguyen DH， Gummuluru S， Hu J. Deamination-independent inhibition of hepatitis B virus reverse transcription by APOBEC3G[J].J Virol，2007，81(9):4465-4472.
[4] Rose KM， Marin M， Kozak SL， et al. Transcriptional regulation of APOBEC3G， a cytidine deaminase that hypermutates human immunodeficiency virus [J]. J Biol Chem，2004，279(40):41744-41749.
[5] Chiu YL， Greene WC. APOBEC3G: an intracellular centurion [J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2009，364(1517):689-703.
[6] Bonvin M， Greeve J. Hepatitis B: modern concepts in pathogenesis-APOBEC3 cytidine deaminases as effectors in innate immunity against the hepatitis B virus [J].Curr Opin Infect Dis，2008，21(3):298-303.