【摘要】 目的 研究核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)逆转K562/AO2细胞耐药效应及其机制。方法 采用MTT比色法分别检测K562/AO2细胞的耐药性、PDTC对K562/AO2细胞增殖的影响以及非细胞毒剂量PDTC、维拉帕米(Ver)预作用后K562/AO2细胞药物敏感性的变化，采用免疫细胞组织化学法、RT-PCR检测K562、K562/AO2细胞NF-κB、mdr-1 mRNA表达水平以及PDTC作用一定时间对其影响。结果 ①K562/AO2细胞对阿霉素(ADM)的耐药性是K562细胞的59倍;非细胞毒剂量PDTC预作用后，ADM对K562/AO2细胞的半数抑制浓度(IC50)显著降低，相对逆转耐药效率为93.03%，强于经典耐药逆转剂Ver的作用81.07%(P<0.01);②K562/AO2细胞NF-κB表达水平高于K562细胞(P<0.01);PDTC可有效抑制K562/AO2细胞NF-κB表达，伴随mdr-1 mRNA表达减少，呈时间依赖性。结论 抑制NF-κB异常活化可部分逆转K562/AO2细胞耐药性，其机制与mdr-1 mRNA转录表达减少有关。
【关键词】 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐;核因子κB;K562/AO2细胞;多药耐药;mdr-1基因
Abstract: Objective To investigate the effect of pyrrolidine dithioearbama (PDTC)， an inhibitor of nuclear factor κB (NF-κB) activity on reversing the chemoresistance of K562/AO2 cells and its mechanism. Methods Human erythroleukemic cell line K562 and its adriamycin-resistant counterpart K562/AO2 cells were used in the study. MTT assay was employed to detect the multiple drug resistance of K562/AO2 cells， the effect of PDTC on cell proliferation and the variations in drug sensitivity of K562/AO2 cells pretreated with PDTC/Verapamil (Ver) in noncytotoxic dose. Immunocytohistochemical method and RT-PCR were used to detect the relative expression of NF-κB and mdr-1 mRNA in K562 and K562/AO2 cells， respectively， and the effect of PDTC treatment at different time points. Results ①The drug resistance of K562/AO2 cells to ADM was 59 times as much as that of K562 cells. When pretreated with PDTC in noncytotoxic dose， the IC50 of ADM in K562/AO2 cells had a marked decrease， with a relative reverse efficiency of 93.03%， while that of classic modifying agents Ver was 81.07% (P<0.01); ②The NF-κB expression level of K562/AO2 cells was significantly higher than that of K562 cells (P<0.01); DTPC effectively inhibited the NF-κB expression of K562/AO2 cells， accompanied by the down-regulated expression of mdr-1 mRNA， in a time dependent manner. Conclusion With its inhibitory effect on the abnormal activity of NF-κB， PDTC can partially reverse the multidrug resistance of K562/AO2 cells， the mechanism of which might be associated with the down-regulation of mdr-1 mRNA.
Key words: pyrrolidine dithioearbama; nuclear factor-kappa B; K562/AO2 cell; multidrug resistance; multidrug resistance gene-1
多药耐药(multidrug resistance，MDR)于1970年由Biedler和Riehm[1]首次报道，是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物交叉耐药。MDR是化疗失败和肿瘤复发的主要原因，成为当前肿瘤药物治疗中亟待解决的问题。多药耐药机制复杂，以mdr-1/P-gp研究最为广泛和深入[2-3]。我们前期的研究发现，抑制核因子κB(NF-κB)的异常活化可以诱导肿瘤细胞凋亡[4]，本实验进一步研究NF-κB对K562/AO2细胞mdr-1 mRNA表达的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青生物公司，PDTC、MTT购自Sigma公司，阿霉素(ADM)购自浙江海正药业公司，维拉帕米(Ver)购自上海禾丰制药公司，NF-κB鼠抗人单克隆抗体购自Santa Crus公司，二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，细胞总RNA提取试剂盒、RT-PCR第一链cDNA合成试剂盒、PCR试剂盒、DNA Marker购自天为时代科技有限公司。
1.2 细胞株及培养 人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株K562、人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞ADM耐药株K562/AO2均购自中科院血研所。实验前两株细胞均培养于含10%胎牛血清，青、链霉素各100×103 U/L的RPMI 1640培养基中，置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中。K562/AO2细胞在培养过程中加ADM 1 mg/L以维持耐药性，实验前2周停药。
1.3 方法
1.3.1 MTT法检测PDTC对K562/AO2细胞生长的影响 调整K562/AO2细胞密度为2×105/ml铺96孔板，各孔加入100 μl 细胞悬液和100 μl不同浓度PDTC(终浓度0.04、0.16、0.6、2.5、10、40、160 μmol/L)，设等量PBS孔调零、等量细胞悬液和培养基孔做对照，培养48 h后每孔加入5 g/L的MTT 20 μl，继续孵育4 h后离心吸弃上清，各孔再加150 μl二甲亚砜(DMSO)，平行震荡15 min使甲瓒充分溶解，用酶标仪在570 nm波长处测各孔光密度(D)值。每组设3复孔，实验重复3次。细胞存活率=(D实验孔-D调零孔)/(D对照孔-D调零孔)×100%。
1.3.2 MTT法检测ADM对细胞的半数抑制浓度(IC50) 调整K562、K562/AO2细胞密度为2×105/ml铺96孔板，各孔加入100 μl细胞悬液和100 μl不同浓度ADM (终浓度0.01、0.1、10、100 mg/L)，预作用药物PDTC(0.2 μmol/L，预实验取值)、Ver(5 mg/L)于加ADM前1 h加入，同上用MTT法测各孔D570 nm值。Logit法计算IC50。耐药倍数=IC50 A/IC50 C，相对逆转效率=(IC50 A-IC50 B)/ (IC50 A-IC50 C)×100%;IC50 A是K562/AO2细胞的IC50，IC50 B是PDTC或Ver预作用后K562/AO2细胞的IC50，IC50 C是K562细胞的IC50。
1.3.3 免疫细胞组织化学法检测NF-κB表达 实验分3组：K组，K562细胞无干预组;K/A组，K562/AO2细胞无干预组;K/A+P组，K562/AO2细胞+ 0.2 μmol/L PDTC组，各组分别于培养6、12、24、48 h取样，调整细胞密度为5×105/ml，取50 μl滴于多聚赖氨酸处理的玻片上，37℃干燥1 h，冷丙酮固定10 min，加0.2% Triton破膜20 min，3% h3O2室温孵育5 min，滴加NF-κB单抗，4℃过夜后滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育30 min，最后滴加DAB显色。以细胞核出现棕黄色颗粒为染色阳性，LEICA Qwin图像处理与分析系统分析。每张玻片选取5个不同视野，每个视野选取10个不同细胞，以背景和细胞核灰度值(GSN)均值之差表示NF-κB活化程度。
1.3.4 RT-PCR检测mdr-1 mRNA表达 分组、取样时点同1.3.3，收集各组细胞5×106个，按TRIzol试剂盒说明提取总RNA，逆转录为cDNA。自行设计mdr-1基因引物序列(上海生工公司合成)：上游5′-GTA CCC ATC ATT GCA ATA G-3′，下游5′-ATG TTC AAA CTT CTG CTC CT-3′，扩增产物为162 bp。内参照β-actin的引物：上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，扩增产物为452 bp。PCR反应体系25 μl，参数：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共进行35个循环，最后72℃延伸10 min。取上述产物 6 μl，用1%琼脂糖凝胶(含溴乙锭0.5 mg/L)电泳，UVP凝胶成像系统成像，Image J 软件半定量分析。
1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 PDTC对K562/AO2细胞生长的影响 0.04～160 μmol/L PDTC作用48 h对K562/AO2细胞生长均有抑制作用，呈浓度依赖性(表1)。为尽量减少PDTC本身细胞毒作用对结果的影响，后续试验选择的PDTC剂量比较小，预试验显示0.2 μmol/L PDTC作用K562/AO2细胞48 h后，该组D值与对照组相比无统计学差异 (P>0.05)，故选择此非细胞毒剂量进行试验。表1 不同浓度PDTC作用48 h对K562/AO2细胞生长的影响与对照组比较：*P<0.05;与前一浓度组比较：△P<0.05
2.2 ADM对细胞的半数抑制浓度 ADM对K562细胞的IC50是(0.57±0.07) mg/L，而对K562/AO2细胞的IC50是(33.72±1.72) mg/L，相当于K562细胞的59倍(P<0.01)。0.2 μmol/L PDTC预作用后，K562/AO2细胞对ADM的药物敏感性明显提高，IC50降至(2.88±0.42) mg/L，相对逆转效率93.03%，强于经典的耐药逆转剂Ver(P<0.01)
2.3 PDTC对K562/AO2细胞NF-κB表达的影响 K562/AO2细胞NF-κB表达水平明显高于K562细胞(P<0.01)。0.2 μmol/L PDTC可抑制K562/AO2细胞NF-κB表达，作用6 h即发现核内棕黄色颗粒开始减少，在24 h降至最低点，接近同条件下K562细胞水平(P>0.05)，以后逐渐回升，抑制作用持续到48 h。 K562和K562/AO2细胞无干预组NF-κB表达水平在观察的48 h中无变化(P>0.05)(表2、图1)。表2 PDTC对K562/AO2细胞NF-κB表达的影响
2.4 PDTC对K562/AO2细胞mdr-1 mRNA表达的影响 K562细胞基本不表达mdr-1 mRNA，而K562/AO2细胞却高表达(P<0.01)。0.2 μmol/L PDTC作用12 h后，K562/AO2细胞mdr-1 mRNA表达开始下调，抑制作用在观察的48 h内呈时间依赖性，至48 h K562/AO2细胞仍有一定程度的mdr-1 mRNA表达，与K562细胞相比有差异(P<0.01)。K562和K562/AO2细胞无干预组mdr-1 mRNA表达48 h内无变化(P>0.05)(表3)。图1 0.2 μmol/L PDTC作用不同时间对K562/AO2细胞NF-κB表达的影响(二步法免疫组化，×400)
3 讨 论
NF-κB是一种重要的转录调节因子，1986年由Sen和Baltimore[5]从成熟的B细胞中提取出来。研究发现，静息状态下NF-κB同胞质中的天然抑制因子IκB(Inhibitor of κB)结合成三聚体处于失活状态。当细胞受到各种刺激(如化疗药物、电离辐射、细胞因子等)作用时，IκB在上游IκB激酶(IKK)调节下N端的Ser32/36磷酸化，随后该区Lys21/22泛素化，最终在蛋白酶体的作用下迅速降解，释放NF-κB，后者进入胞核和靶基因的顺式作用元件κB位点结合，从而启动基因的转录[6]。目前已知NF-κB调控的靶基因有一百多种，参与炎症、免疫应激、细胞增殖与凋亡、肿瘤形成等。
K562/AO2细胞是杨纯正等由K562细胞经过长期浓度梯度ADM诱导、筛选后建立的一株典型的MDR细胞，mdr-1/P-gp高表达是其主要的耐药机制。本实验条件下，ADM对K562/AO2细胞的IC50是K562细胞的59倍，K562/AO2细胞mdr-1 mRNA表达显著高于K562细胞(P<0.01)，表明K562/AO2细胞在添加ADM的培养条件下保持了一定的耐药性，并且稳定表达mdr-1 mRNA，与文献报道一致[7]。我们的实验发现，K562/AO2细胞同时存在NF-κB和mdr-1的表达，且相对于K562细胞均明显增高(P<0.01)。Um等[8]用凝胶阻滞实验也发现多药耐药的人白血病细胞CEM/VLB100和鼠耐药乳腺癌细胞FM3A/ M中NF-κB活性均较其相应的敏感细胞显著提高。这促使我们进一步研究多药耐药的K562/AO2细胞中，NF-κB是否参与mdr-1的表达调控，是否可以NF-κB为靶点逆转耐药。
PDTC是一种抗氧化剂，研究[9]发现它通过阻断IκB的从头磷酸化，抑制IκBα降解失活，从而阻止NF-κB活化入核，成为实验常用的NF-κB抑制剂。我们观察到，PDTC单独作用于K562/AO2细胞即可呈浓度依赖性抑制其生长。0.2 μmol/L PDTC作用48 h后，K562/AO2细胞存活率与对照组无差异，但NF-κB表达明显减少，我们认为此浓度条件下既能排除PDTC本身的直接毒性作用，又可检测抑制NF-κB活化对细胞耐药性的影响。这一浓度与国内外相关研究[10]有差异，考虑可能与研究目的不同，细胞种类、细胞密度不同等有关。实验显示，非细胞毒剂量PDTC有效抑制K562/AO2细胞NF-κB的异常活化，对K562/AO2细胞耐药性起到了部分逆转作用，相对逆转效率为93.03%，强于经典逆转剂Ver (P<0.01);随着作用时间的延长，K562/AO2细胞mdr-1表达也逐渐下调。
我们的实验结果提示，K562/AO2细胞中NF-κB可能参与mdr-1基因的表达调控。Bentires-Alj等[11]证实mdr-1基因启动子区域的第一外显子包含一个纯化的NF-κB结合序列(5′-CCTTTTCGGGG-3′)，而NF-κB也的确能够激活连接mdr-1基因启动子的报告基因转录，这表明mdr-1有可能是NF-κB下游基因之一，在NF-κB 的调节下激活转录而引起肿瘤细胞耐药。
多药耐药是目前肿瘤治疗中面临的一个棘手难题，克服肿瘤多药耐性，提高肿瘤化疗效果意义重大。而NF-κB作为一种广泛存在和功能多样的转录因子，特别具有实际意义的是它可能在转录水平从多方面参与多药耐药性的形成，以NF-κB为靶点提高化疗效果特别值得我们进一步去研究和探索。
参考文献
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