作者：王红梅，肖玉洁，韩正祥，高向阳3，裴冬生，杜秀平
【摘要】 目的 制备基因载体壳聚糖纳米粒，研究其结构特征及其体外对细胞的转染活性。方法 以复凝聚法制备壳聚糖-pDNA纳米粒;电镜测定其形态、粒径;凝胶电泳阻滞实验观察壳聚糖和pDNA的结合力;紫外可见分光光度计测定其负载力、负载率;体外转染入人胚肾细胞293T，荧光显微镜观察转染效率，CCK8法评价细胞毒性。结果 壳聚糖-pGFP 纳米粒多呈球形，直径为(132±48)nm;凝胶电泳阻滞实验示pGFP被完全包裹在纳米粒内;其负载力(LC)为(48.2±2.0)%，负载率(LE)为100%;体外转染实验证明壳聚糖-pGFP纳米粒能介导pGFP转染293T细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白;壳聚糖-pDNA抑制率(26.08±4.28)%。结论 采用复凝聚法制备的壳聚糖-pDNA纳米粒可有效转染至细胞内，但有一定的细胞毒性。
【关键词】 壳聚糖;纳米粒;基因载体;转染
Abstract:Objective To prepare chitosan nanoparticles as gene vectors so as to investigate their structural characteristics and cell-gene transfection efficiency in vitro.Methods The chitosan-pDNA nanoparticles were prepared by a complex coacervation method and their morphology as well as the particle diameter were observed under the electronic microscope. The binding of pDNA was evaluated by agarose gel electrophoresis analysis; the loading capacity and loading efficiency were determined with UV/Vis spectrophotometer. The transfection experiments were performed with human embryonic kidney 293T cell line in vitro. The transfection efficiency was measured under fluorescent microscope. The cytotoxicity was observed with Cell Counting Kit-8 (CCK-8).Results The chitosan-pDNA nanoparticles were mainly spherical， with an average diameter of (132±48)nm. The agarose gel electrophoresis analysis confirmed the DNA was wholly encapsulated in the nanoparticles. The loading capacity was (48.2±2.0)% and loading efficiency was 100%. Transfection in vitro proved that chitosan-pDNA was efficient in 293T cells and the expression of green fluorescent proteins was observed under fluorescent microscope. The inhibition percentage of nanoparticles was (26.08±4.28)%.Conclusions The chitosan-pDNA nanoparticles can be effectively transfected into cells. A certain degree of cytotoxicity was observed by CCK8， though.
Key words： chitosan; nanoparticles; gene vector; transfection
基因治疗为近年研究热点，高效低毒的载体为基因治疗的关键[1]。壳聚糖作为一种聚阳离子基因载体，是由葡糖胺和N- 乙酰基葡糖胺构成的生物共聚物，有较好的生物相容性和生物可降解性，免疫原性低，毒性小;而且壳聚糖易于和带负电荷的DNA形成纳米级复合物，能有效保护DNA免受核酸酶的降解[2]。目前被认为是很有潜力的基因递送载体[3]。本研究以壳聚糖作为载体，制备壳聚糖-pDNA纳米粒，观察其结构特征，并在细胞水平上测定其转染效果。
1 材料和方法
1.1 材料 壳聚糖(分子式：C12 h34 N2O9，分子质量：340)购自Sigma-Aldrich公司，脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen 公司，293T人胚胎肾细胞购自中科院上海细胞库，表达绿色荧光蛋白的质粒PGPU6/GFP/Neo-shNC购自上海吉玛公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 293T人胚胎肾细胞培养于含10%新生牛血清、1×108 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640+HEPES培养液中，置于37℃、5%二氧化碳培养箱培养。每3～5天按1∶3～1∶5的比例进行传代。
1.2.2 壳聚糖-质粒(pDNA)微粒体的制备(复凝聚法) 取壳聚糖500 mg，溶解于1%乙酸溶液，浓度0.5%(pH 4.5)，超声震荡至澄清，121℃，高压灭菌20 min备用。 pDNA溶解于灭菌20%Na2SO4溶液中，浓度为25 mg/L。取0.5%的壳聚糖与等体积的pDNA溶液混合，在漩涡混合器上充分混匀后，12000 r/min、4℃离心20 min， 沉淀物以PBS重悬，此为壳聚糖-pDNA微粒混悬液。
1.2.3 壳聚糖-pDNA纳米粒的形态和粒径测定 取少量壳聚糖-pDNA纳米粒混悬液，滴至铺有碳膜的铜网上，静置2 min，用滤纸吸干混悬液，再滴加1%(W/V)磷钨酸复染2 min，于透射电子显微镜下观察微粒形态并拍照。
1.2.4 壳聚糖-pDNA纳米粒凝胶电泳阻滞实验 分别取裸pDNA液、壳聚糖-pDNA混悬液、壳聚糖液及制备壳聚糖-pDNA混悬液离心后上清液20 μl，以1%琼脂糖凝胶水平电泳实验。
1.2.5 壳聚糖包封pDNA测定 将制备的壳聚糖-pDNA纳米粒混悬液尽可能吸尽上清液，冻干、称重，标记为W0。收集上清液，UV法在波长260 nm处测定上清液未结合pDNA浓度，标记为Ws。将制备微粒时pDNA加入量记为WpDNA。按下列公式计算负载力(loading capacity， LC)及负载率(loading efficiency， LE)：LC=(WpDNA-Ws)/W0×100%， LE=( WpDNA-Ws) /WpDNA×100%。
1.2.6 体外转染实验 将293T细胞接种于6孔板，每孔接种6×105个细胞，继续培养细胞约24 h(细胞融合60%～70%)，使细胞达对数生长期，进行转染实验。设立壳聚糖-pDNA孔、脂质体Lipofectamine 2000阳性对照孔、阴性对照孔、空白孔，每组设3个复孔。吸尽旧培养基，将壳聚糖-pDNA纳米粒混悬液500 μl(质粒2.5 μg/孔)加入壳聚糖-pDNA孔中，同时制备500 μl脂质体-pDNA复合物加入阳性对照孔中，阴性对照孔中放入500 μl壳聚糖悬液，再每孔加入1.5 ml无血清培养基。十字摇匀法混匀，放回CO2培养箱孵育，4～6 h后换成有血清的培养基。24～72 h，荧光显微镜观察细胞内绿色荧光。
1.2.7 CCK8实验 取对数生长期293T细胞接种于96孔板，每孔1×104个细胞，细胞融合至60%～70%时进行转染。设壳聚糖-pDNA孔、脂质体-pDNA孔、壳聚糖孔、空白孔。转染方法同前，质粒为0.1 μg/孔，每组设5个复孔。培养48 h 后，每孔加CCK-8试剂10 μl，再培养4 h。在酶标仪进行双波长测定， 波长450～490 nm，参比波长600～650 nm，测D值。实验重复3次。细胞存活率=(D试验组-D空白组)/(D对照组-D空白组)×100 %，细胞生长抑制率(IR)=(1-细胞存活率)×100 %。
1.3 统计学处理 定量资料用SPSS 13.0统计软件处理，数据以±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。设检验水准：α=0.05。
2 结 果
2.1 壳聚糖-pDNA纳米粒的形态和粒径 透射电子显微镜观察结果表明，壳聚糖-pDNA纳米粒多呈球形(图1)，按放大倍数计算，微粒直径在100～200 nm之间，平均约(132±48)nm。
图1 壳聚糖-pDNA纳米粒电镜照片(×20000)
2.2 壳聚糖-pDNA纳米粒凝胶电泳阻滞实验 凝胶电泳阻滞实验结果如图2。壳聚糖-pDNA纳米粒能阻滞pDNA向阳极移动，使pDNA滞留于加样孔中而发亮，表明pDNA与壳聚糖之间通过静电作用有效凝聚。壳聚糖孔和离心后上清液孔均未见到发亮的pDNA。
图2 壳聚糖-pDNA纳米粒凝胶阻滞实验
1.裸pDNA;2，3.壳聚糖-pDNA纳米粒;4.壳聚糖;5.离心后上清液; 6、7. DNA Marker
2.3 壳聚糖包封pDNA测定 应用UV法测定上清液中未结合pDNA浓度，在260 nm处为负值，pDNA浓度为负值，经计算壳聚糖LC为(48.2±2.0)%，LE为100%，表明壳聚糖完全包封pDNA。
2.4 体外转染实验 转染24 h观察，脂质体质粒转染组有散在的绿色荧光点，壳聚糖质粒组无荧光点。48 h时观察，脂质体组荧光明显增多，亮度增加，壳聚糖质粒组散在绿色荧光，亮度弱，部分细胞脱壁死亡(图3～ 6)。72 h观察荧光均减少，壳聚糖质粒组死亡细胞增多，脂质体质粒组细胞状态基本正常。
荧光显微镜观察48 h时转染率最高。壳聚糖-pDNA 纳米粒组转染率〔(4.25±2.26)%〕，脂质体转染率〔(33.65±7.16)%〕(P<0.05)。
2.5 CCK8实验 壳聚糖-pDNA抑制率(26.08±4.28)%、脂质体-pDNA抑制率(8.66±4.25)%、壳聚糖组抑制率(16.9±3.59)%，壳聚糖-pDNA组抑制率与脂质体-pDNA组相比有明显差异(P<0.05)。壳聚糖也有抑制细胞生长作用。
3 讨 论
壳聚糖是一种弱碱性的天然高分子多聚糖，在酸性条件下溶解，荷正电， 能通过静电作用结合带负电的pDNA 分子， 因为细胞表面带负电荷，其复合物被细胞通过静电作用摄取。根据壳聚糖的这些特点，本实验以复凝聚法制备了壳聚糖-pDNA 纳米粒，对其相关指标进行检测，其直径在100～200 nm，小于细胞膜的孔径，利于细胞顺利摄取。凝胶电泳阻滞实验和负载力，负载率的测定证明pDNA完全被壳聚糖包裹。壳聚糖-pDNA纳米粒的构建是成功可行的。
本实验的体外基因转染以转染效率较高的293T为靶细胞，通过壳聚糖转染pEGFP，结果显示荧光显微镜下细胞内可观察到绿色荧光，说明纳米粒能将绿色荧光蛋白基因递送到细胞内，成功转染并表达绿色荧光蛋白。有研究表明壳聚糖在体内和体外有较好的转染效果[4-6]，Sato等[7]发现，当壳聚糖相对分子质量为15或52 kDa，质粒：壳聚糖为1∶5，pH为6.9，转染培养基含血清时，壳聚糖-DNA微粒的转染效率最好。有很多研究者对壳聚糖进行改性来提高其转染效率[8-9]。本实验结果显示，壳聚糖和阳性对照脂质体比较，转染率低。其原因考虑为壳聚糖-pDNA纳米粒的转染效率受到壳聚糖分子量、粒径、N/P比值、pH值、脱乙酰度、DNA浓度等多种因素的影响。
在CCK8实验中，壳聚糖组及壳聚糖-pDNA 纳米粒组显示出较强的细胞毒性，与脂质体组比较有明显差异(P<0.05)。有学者认为，壳聚糖的细胞毒性与脱乙酰度、化学结构、黏度和相对分子质量有关，同一种壳聚糖对不同的肿瘤细胞有不同程度的抑制作用[10]。本实验中，观察到pH值为一个非常重要的影响因素。壳聚糖为弱碱性，不溶于中性和碱性溶液[11]。培养基中添加HEPES缓冲盐，是以NaHCO3和稀HCl调定，pH值为7.0～7.2，其缓冲能力较强。壳聚糖-pDNA 纳米粒混悬液偏酸，两者混合后，壳聚糖纳米粒在pH值变化后的液体中析出成实验中所见云絮状物，液体渗透压也发生相应变化。细胞对pH值、渗透压变化很敏感，因此镜下观察到脱壁死亡。正因如此，细胞状态差也同时影响了基因的转染率。
综上所述，壳聚糖可有效包封DNA，保护DNA免受降解，可以成功地转染至靶细胞内，其转染条件实验的优化及体外转染效果有待进一步研究。
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