作者：王琳琳，刘晓东，王靖元
【摘要】 目的 研究长期使用抗癫疒间药物(AEDs)对大鼠脑中P-糖蛋白(P-gp)功能活性和表达水平的影响。方法 选择苯巴比妥、苯妥英钠和卡马西平三个典型AEDs，在大鼠体内连续给药21天，然后观察脑组织中皮质和海马P-gp的改变。结果 底物罗丹明123转运实验表明P-gp功能增强，进一步通过Western Blot分析表明P-gp表达增强，并用免疫组化染色显示其细胞定位在血脑屏障上。结论 长期AEDs诱导可以同时导致大鼠血脑屏障上P-gp功能活性和表达水平的升高。
【关键词】 P-糖蛋白;血脑屏障;抗癫疒间药物;诱导
Abstract: Objective To investigate whether chronic exposure of antiepileptic drugs (AEDs) increased P-glycoprotein (P-gp) function and expression in brain of rats. Methods Three drugs phenobarbital (PB)， phenytion (PHT) and carbamazepine (CBZ) were orally given to rats for successive 21 days， P-gp activity and levels in brain was assessed. Results Tissue-to-plasma concentration ratios of Rho123 were significantly decreased in cerebral cortex and hippocampus. Immunohistochemistry result showed that up-regulation of the P-gp mainly occurred in capillary endothelial vessels. Western blot result suggested that the protein level of P-gp in cortex and hippocampus of rats exposed to drugs was significantly higher than that of control rats. Conclusion Chronic exposure of AEDs may increase P-gp function and level in brain of rats.
Key words: P-glycoprotein; Blood-brain barrier; Antiepileptic drugs; Induction
癫疒间是一种慢性神经性疾病，患者中约有30%为难治性癫疒间，严重影响患者的生活质量，成为一个医学难题。越来越多的研究证明，难治性癫疒间患者脑内外排转运体的表达上调，如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance protein，MRP)等[1-2]。血脑屏障主要由单层脑微血管内皮细胞构成，调节和保护大脑微环境。P-gp是血脑屏障上一种重要的外排转运蛋白，许多药物包括一些抗癫疒间药物(antiepileptic drugs，AEDs)都是它的底物[3-4]。有研究发现AEDs诱导的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)中P-gp表达显著高于正常对照组，且呈剂量和时间依赖性[5]。因为BMECs是构成血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的主要形态学基础，那么为了证实AEDs是否也会对BBB上的P-gp产生诱导作用，且其是否是癫疒间患者长期用药后出现治疗失败的原因之一，本实验探讨长期使用AEDs是否可以诱导大鼠脑中P-gp功能活性和表达水平的上调。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 罗丹明123标准品(rhodamine 123，Rho123)购自美国Sigma公司;甲醇为色谱纯(美国Fisher Inc.);苯巴比妥(phenobarbital，PB)购自上海新亚药业有限公司;苯妥英钠(phenytoin sodium，PHT)购自天津力生制药股份有限公司;卡马西平(carbamazepine，CBZ)购自上海三维制药有限公司;鼠anti-P-gp一抗(C219，IgG)购自美国Calbiochem of EMD Biosciences Inc.;IRDyeTM800抗鼠IgG二抗购自美国Rockland Inc.;鼠anti-β-actin单克隆抗体购自中国Boster Biotech公司;其余试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器 LC-10ADVP高效液相色谱仪，RF-10AXL荧光检测器(日本Shimadzu);5810R台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf);61型电泳仪(北京六一仪器厂);半干转膜仪(北京六一仪器厂);6131型核酸、蛋白质含量测定仪(德国Eppendorf Inc.)。
1.3 动物与分组 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重180～200 g，由中国药科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2002-0011。动物实验由中国药科大学动物伦理委员会批准实施。动物随机分组，每组6只，苯巴比妥组给予苯巴比妥15 mg/kg，苯妥英钠组给予苯妥英钠25 mg/kg，卡马西平组给予卡马西平50 mg/kg，正常对照组给予等体积的羧甲基纤维素钠，给药体积为1 ml/100 g。每天灌胃给药2次，连续给药21天。
1.4 方法
1.4.1 P-gp功能分析 给药周期结束后，AEDs诱导组大鼠与正常对照组大鼠静脉注射Rho123 0.2 mg/kg(临用前以生理盐水配制成0.1 g/L，给药体积为2 ml/kg)，60 min后股动脉取血(约3 ml)于肝素化试管中，立即断头处死大鼠，剥取脑皮质与海马。血液离心(4 000 r/min，5min)后取上层血浆，采用甲醇沉淀蛋白，通过HPLC-FLD进行血浆、脑皮质与海马中Rho123浓度测定，具体条件如下：流动相为乙腈-水相(1‰乙酸，2‰三乙胺)=40∶60，流速1 ml/min，检测波长：Ex 485 nm，Em 546 nm，以脑皮质/血浆、海马/血浆的浓度比值进行统计分析。
1.4.2 免疫组织化学染色 给药周期结束后，AEDs诱导组大鼠与正常对照组大鼠用乙醚麻醉后立即断头处死，剥取脑皮质与海马。相对于前囟点-0.8 mm、-3.8 mm分别取含皮质、海马结构的2～3 mm厚脑块(冠状切面)，置福尔马林溶液中梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片。石蜡切片常规脱蜡和水化后，加50 μl过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次;加50 μl正常非免疫动物血清，室温下孵育10 min;加100 μl一抗(1∶100稀释)，37℃孵育60 min;加50 μl二抗(1∶100稀释)，室温下孵育10 min，PBS冲洗3 min×3次;加50 μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min， PBS冲洗5 min×3次;DAB显色，脱水，透明，封片。
切片在Olympus-Vanox显微镜下观察并照相，照片导入Image Pro-Plus显微图像分析系统进行数据分析，选定阳性细胞后获得光密度(D值)表示P-gp免疫反应强度。
1.4.3 蛋白印迹检测P-gp表达 定量称取大鼠脑皮质、海马，加入Chaps裂解液冰浴裂解1 h，离心取上清液;膜蛋白液经核酸定量仪测定后100℃、5 min 变性;加入4×loading buffer上样， 100 V电泳2.5 h;转膜，10%脱脂奶粉37℃封闭1 h;PBST清洗10 min×3 次，加入一抗C219(1∶200) 37℃孵育1 h，4℃过夜;PBST清洗10 min×3次，加入二抗(1∶5 000) 37℃孵育1 h;PBST清洗10 min×3次，显影。
1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行处理，各组数据均以±s表示。各组数据总体差异的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用q检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 P-gp功能的变化 本实验使用经典的P-gp底物Rho123对P-gp的功能活性进行分析，结果见表1。21天的AEDs给药导致Rho123在脑皮质和海马中的浓度降低，而血浆中的浓度未见明显变化，使得Rho123脑皮质/血浆浓度比、海马/血浆浓度比显著降低。CBZ、PHT、PB组脑皮质/血浆浓度比较正常对照组显著下降(P<0.05或P<0.01)，PHT、PB组海马/血浆浓度比较正常对照组显著下降(P<0.01)，而CBZ组无明显差异(P>0.05)。表1 Rho123在脑皮质和海马中分布的变化
C：脑皮质;H：海马;P：血浆;与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.012.2 免疫定位与反应强度的变化 P-gp抗体C219的免疫定位主要位于组成血脑屏障的毛细血管内皮细胞顶膜上，阳性细胞被染成棕黄色。通过进一步半定量分析免疫反应强度(D值)发现，长期CBZ、PB和PHT诱导的大鼠，脑皮质的D值均高于正常对照组大鼠，但无显著性差异，按D值大小排列：PB组>CBZ组>PHT组>正常对照组;海马的D值均高于正常对照组大鼠，且均具有显著性差异(P<0.05)，按D值大小排列：PHT组>CBZ组>PB组>正常对照组(同一张切片，在高倍镜下任取3个观察视野，获得的D值取平均值作为一个动物的数据)。见图1。
2.3 P-gp表达的变化 Western Blot 分析显示，P-gp在AEDs诱导大鼠脑皮质中有较高表达，与正常对照组大鼠比较，CBZ、PHT、PB组表达的增加具有显著统计学差异(P<0.01);P-gp在AEDs诱导大鼠海马中也有较高表达，表现与脑皮质中相似的变化趋势，与正常对照组大鼠比较，CBZ、PHT、PB组表达的增加具有显著统计学差异(P<0.01)。见图2。
3 讨 论
本实验结果表明，AEDs长期诱导过程可能有促使大鼠不同脑区上P-gp表达上调的作用;而在P-gp功能活性分析中，AEDs诱导可以显著降低大鼠Rho123脑皮质/血浆比、海马/血浆比，说明AEDs诱导可能同时引起P-gp表达和活性的增强。在这些AEDs中，PHT显示最强的P-gp诱导作用，包括P-gp表达水平的诱导和P-gp功能活性的诱导。CBZ诱导大鼠海马的P-gp表达和功能的变化之间存在一定的差别，CBZ诱导大鼠的海马表现出比正常对照组大鼠更高的P-gp表达水平和免疫反应强度，但P-gp的功能活性与正常对照组大鼠相似。这一现象在其他文献中也有报道，Owen等[6]的实验称CBZ可能不是P-gp的底物，不影响Rho123的外排;但CBZ却可以在外周血淋巴细胞中诱导P-gp的表达[7]，此现象的内在机制在文献中仍不明确。同时，P-gp表达水平的升高程度在不同的脑区存在差异，长期PHT诱导大鼠海马的P-gp表达水平升高的幅度要大于相应皮质升高的幅度;相反，长期CBZ和PB诱导大鼠皮质的P-gp表达水平升高的幅度要大于相应海马升高的幅度。
底物转运、免疫组织化学定位、蛋白印迹分析三个方面的结果均表明长期AEDs诱导可以同时导致大鼠血脑屏障上P-gp功能活性和表达水平的升高，较好地印证“长期AEDs诱导是耐药性癫疒间P-gp过度表达的机制之一”的假说。
参考文献
[1] Sisodiya SM. Mechanisms of antiepileptic drug resistance [J]. Curr Opin Neurol，2003，16(2):197-201.
[2] Tishler DM， Weinberg KI， Hinton DR， et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy [J]. Epilepsia，1995，36(1):1-6.
[3] 吴玉林，祝浩杰，郑莉，等. 洛美利嗪对大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响[J]. 中国药科大学学报， 2003， 34(4): 352-325.
[4] Potschka H， Fedrowitz M， Lscher W. P-Glycoprotein-mediated efflux of phenobarbital， lamotrigine， and felbamate at the blood-brain barrier: evidence from microdialysis experiments in rats [J]. Neurosci Lett，2002，327(3):173-176.
[5] Lü Y， Yan Y， Wang XF. Antiepileptic drug-induced multidrug resistance P-glycoprotein overexpression in astrocytes cultured from rat brains [J]. Chin Med J (Engl)，2004，117(11):1682-1686.
[6] Owen A， Pirmohamed M， Tettey JN，et al. Carbamazepine is not a substrate for P-glycoprotein [J]. Br J Clin Pharmacol，2001，51(4):345-349.
[7] Owen A， Goldring C， Morgan P，et al. Induction of P-glycoprotein in lymphocytes by carbamazepine and rifampicin: the role of nuclear hormone response elements [J]. Br J Clin Pharmacol，2006，62(2):237-242