【关键词】 胶质细胞源性神经营养因子；神经保护；脑缺血
胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）在神经系统的发育、生长、损伤及修复等过程中发挥重要的神经营养作用，在神经系统中的分布广泛，其神经营养活性较高，不仅可以保护多巴胺（DA）运动神经元，对于中枢及外周的运动神经元、感觉神经元及交感神经元等多种神经元具有同等的营养作用，在神经系统变性性疾病及缺血性脑血管疾病等治疗中发挥重要作用，已经成为当前神经科学领域研究的热点。
1 GDNF的基本结构
GDNF最先由Lin等［1］于1993年从大鼠胶质细胞B49的条件培养液中分离出来，因其主要来源于神经胶质细胞，故人们将其命名为胶质细胞源性神经营养因子。每个GDNF成熟蛋白质氨基酸序列中都有7个保守的半胱氨酸残基［2］，并且半胱氨酸出现的位置与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的所有成员相似，故因其结构特点将其归属于TGF-β超家族的新成员。
2 GDNF及其受体的分布
GDNF在全身各种组织中均有表达［3］，并不单一表达于富含多巴胺能神经元的部位，如中脑的黑质。GDNF的mRNA在体内神经系统非多巴胺能神经元部位也可以检测到，在外周非神经组织中也有表达，在小脑蒲肯野细胞、三叉神经运动核等与运动有关的结构以及三叉神经感觉核、脊髓后角Clarksy核等与感觉有关的结构中也可以检测到。GDNF在机体各个组织及器官中的广泛表达均提示其作用广泛。
3 GDNF受体信号传导系统
GDNF发挥作用的机制主要是与其受体结合，从而发挥其生物学作用。GDNF 受体系统并不是TGF-β超家族的受体：跨膜丝氨酸或者苏氨酸受体，它们有自己的受体部分，为GDNF家族受体α（GDNF family receptor α，GFRα）和Ret蛋白组成的复合受体系统。一部分通过糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol，GPI）结合位点锚定于细胞膜外表面的GFRα，信号不能通过细胞膜；另一部分通过跨膜的酪氨酸激酶Ret蛋白，信号得以传递。GDNF受体α目前已知有4种亚型，分别为GFRα-1～4型。而其中GFRα-1是GDNF最主要的受体。跨膜的Ret蛋白是原癌基因c-ret的编码产物，它属于受体酪氨酸激酶超家族成员，由胞外区、跨膜区和胞内的酪氨酸激酶区构成，能够调节细胞的生长、分化［4］。GDNF与细胞表面的GFRα 结合形成GDNF-GFRα复合体后激活Ret受体［5］，促使细胞内Ret-Shc-Grb2蛋白复合体形成。而后，Ret-Shc-Grb2蛋白复合体激活相关蛋白，从而引起一系列信号传导，发挥其生物学作用。GDNF可能通过的信号传导通路［6-8］：①通过Ras/MAPK通路和PI3K/Akt信息系统刺激神经元的存活、增殖、分化、迁移和轴突的发生、生长。②通过神经营养因子（NTFs）/Src家族蛋白激酶（SFKs）信号通路促进脊髓背根神经元轴突生长。③GDNF通过MEK1/2或者ERK1/2等影响胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的分泌来调节星形胶质细胞的增生。④通过PLC-γ/IP3调控Ca2+释放。最新研究表明［9-10］，GDNF可以不依赖Ret而只通过GFRα-1或者神经细胞黏附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）激活细胞内信号通路。在缺乏Ret蛋白时，GDNF可以通过GFRα-1受体引起促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酶C-γ、cAMP反应要素结合蛋白等蛋白磷酸化以及c-fos mRNA的表达［7］而发挥作用。
4 GDNF的生物学功能
4.1 GDNF对帕金森病(PD)的作用
GDNF一直被认为是对多巴胺能神经元具有高特异性、相对专一性的营养因子。GDNF能够保护和恢复轴索损伤或者1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropy-ridine，MPTP)损伤的DA能神经元的功能。研究表明［11］：腺病毒介导的GDNF基因脑内直接转移可阻止6-OHDA诱发的大鼠DA 能神经元进行性变性，在PD保护治疗方面起到重要作用；另外GDNF 直接注入黑质附近也能促进存活DA能神经纤维发芽及功能恢复。经GDNF处理后的纹状体DA能神经元酪氨酸羟化酶免疫活性可以升高。同时GDNF能够阻止或逆转PD动物模型中黑质纹状体DA系统的进行性退变，含有GDNF基因的质粒注射到PD病鼠的纹状体内，可以明显改善大鼠的功能［12］。因此GDNF是迄今为止所鉴定出的对中脑DA能神经元神经营养作用最强大的营养因子之一。
4.2 GDNF在脑缺血中的作用
在大鼠大脑中动脉闭塞模型中，缺血可诱导GDNF mRNA蛋白表达，且反应性星形胶质细胞可分泌GDNF。大脑缺血可以使GFRα-1、GFRα-2表达上升。短暂结扎大鼠大脑中动脉后检测到GDNF受体GFRα-1和Ret的表达，GFRα-1和Ret表达与同样条件下GDNF的诱导表达相关。所有研究均表明GDNF系统在脑缺血/再灌注损伤中被激活，从而发挥着内源性的神经保护作用。GDNF可能通过以下途径对缺血起到保护作用：①对于脑缺血后脑内微环境的研究提示，神经营养因子不仅可促进神经系统发育，还对脑损伤的修复起重要作用，其能够促进多种神经元的存活和分化，促进骨髓基质干细胞向神经元转化［13-14］。GDNF可以抑制一氧化氮合酶（NOS）活性，减少缺血激活NO本身诱导的毒性反应。导入GDNF重组腺病毒可以提高受损神经元的存活率。②抑制细胞凋亡。凋亡是细胞程序性自杀，凋亡的调节受到凋亡相关蛋白Bcl-2基因家族的控制，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的重要成员，Bcl-2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，二者比例决定着细胞的命运。Yu等［15］在短暂性前脑缺血模型中用GDNF预处理后，死亡的神经元数明显减少，证明GDNF可以通过抑制caspase-3的活性而并不是caspase-1途径抑制缺血刺激后星形胶质细胞的凋亡。有研究发现Par-4与神经细胞的凋亡密切相关，实验表明应用GDNF可以通过抑制Par-4的表达从而抑制神经细胞的凋亡［16］。此外，GDNF可以增强内源性神经干细胞（NSCs）增殖和分化［13-14］。Chen等［17］发现加入重组人类GDNF(rhGDNF)后，存活神经元数目明显增加， 呈现显著的神经保护作用。Gomes等［18］的研究也揭示了GDNF可以抑制谷氨酸受体NMAD，从而降低其毒性反应。以上途径均可以减少神经元的凋亡，同时促进神经元恢复。将GDNF目的基因与相关载体在体外连接形成的重组DNA分子转染至人骨髓间充质干细胞（hMSCs），通过静脉将其输注到体内，成为卒中治疗的新策略。③抑制星形胶质细胞过度增生。星形胶质细胞在神经系统发育、突触传递、神经组织修复与再生、神经免疫以及多种神经疾病的病理机制等方面起着十分重要的作用。在脑缺血缺氧发生后，胶质细胞在缺血区反应性的增生，一方面可以对神经元有一定的保护作用；另一方面，由于胶质细胞的过度增生引起胶质化，形成胶质瘢痕影响神经元的修复。Fukuda等［19］的研究表明GDNF可以部分抑制细胞周期蛋白，从而阻止细胞增生进程。研究指出NCAM成为GDNF的受体，Krushel等［20］研究表明NCAM无论在体内还是体外的实验中都可以抑制星形胶质细胞增生，是否二者有一定的相关性需要进一步探究。这与1993年Lin等［1］发现中脑培养物中加入GDNF后星形胶质细胞的密度并没有增加，其GFAP的表达也没有增加部分吻合。最近的研究还表明阻断P2Y1受体可以抑制GFAP的表达，但是同时可以促进GDNF的生成。这将为后续GDNF对细胞增生抑制的研究提供基础。④抑制钙超载。脑缺血后因为短时间内ATP即可耗尽，细胞膜Ca2+泵因此受到破坏，Ca2+平衡失调，Ca2+内流从而形成钙超载。进一步激活蛋白酶，破坏细胞膜和线粒体，导致细胞死亡。与此同时，一个细胞内游离钙的升高能够在相邻的细胞间传播，使周围的细胞胞内游离钙亦升高，形成细胞间钙波（interceellular calcium waves）。复杂的钙离子信号与星形胶质细胞钙波的存在给这些细胞提供了易兴奋的环境。缝隙连接介导的钙波传导参与了抑制性扩散（SP）的形成，引起了其周围的神经元细胞内钙的升高，使其去极化，激活的星形胶质细胞与神经元释放K+和谷氨酸，K+和谷氨酸则促进神经元与星形胶质细胞内钙的进一步升高，这一正反馈形成了SP的连续不衰减的传导。有实验证明，GDNF参与细胞内Ca2+稳态的调节，影响细胞膜Ca2+通道蛋白的表达，减少Ca2+内流和自由基引起的损伤，可以对神经元起到营养和保护作用。体外的实验也表明，在缺血的海马中加入GDNF能够有效地降低谷氨酸引起的Ca2+升高，对海马隔区及皮质神经元Ca2+的升高有抑制作用。
4.3 GDNF对运动神经元的作用
GDNF是一种运动神经营养因子，GDNF对发育或者成熟的运动神经元有神经营养活性，是目前发现的神经营养因子中作用最强的，其不仅能够促进正常运动神经元的存活，降低自然发生的细胞死亡，还能够阻止运动神经元的退行性病变，对轴突损伤后神经元胞体有保护作用，对已经受损的运动神经元有营养作用［21］。其功能目前考虑部分与GDNF能够阻止运动神经乙酰胆碱转移酶活性下降的因素有关。外源性的GDNF能够支持新生鼠面神经元横断后的存活，GDNF可以完全阻止新生小鼠脊髓运动神经元横断造成的运动神经元死亡和幸存的运动神经元的萎缩。研究发现在含有脑和脊髓运动神经元的培养液中加入GDNF基因转染载体细胞，可以延长这些运动神经元轴索的长度，减少正常凋亡。
4.4 GDNF对神经性疼痛和感觉纤维再生的作用
神经病理性疼痛是指由中枢或周围神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征，目前其发生机制尚未完全清楚，正越来越受到医学界的重视，如何更好地控制疼痛的发作成为研究的重点。虽然临床上已经采用了多种药物混合治疗和其他的镇痛手段，但疗效却并不十分理想。近来研究表明，GDNF对初级传入神经元具有营养和促进再生作用，而且与脊髓背角的伤害性感觉形成有关，因此与神经病理性疼痛有着密切的联系［22］。这为疼痛的治疗提供了一个新的平台。GDNF在缺血损伤后能减轻损伤部位炎症细胞的聚集，从而减少了损伤引起的后角Ⅳ～Ⅷ板层神经元丢失并提高了突触素的表达［23-24］。有研究显示GDNF在大鼠坐骨神经结扎(chronic congtriction injury，CCI)疼痛模型实验中具有明显的镇痛作用［25］。Boucher等［26］将大鼠的一侧坐骨神经或腰部脊神经结扎后使用GDNF，结果显示GDNF可预防神经痛，同时发现手术前后给予GDNF均可逆转手术所引起的感觉异常，考虑GDNF可能通过阻止了神经病理性疼痛时河豚毒素敏感型钠通道的过度表达而发挥作用。GDNF可以促进纤维生长并具有保护作用，从而可以促进感觉纤维的再生。在对大鼠面神经切断的动物模型的研究中发现，应用GDNF后有髓神经纤维长入8 mm长的神经断裂缺损沟。
4.5 GDNF对癫疒间的作用
局部神经元同步化的异常放电是癫疒间发病的重要机制，目前有证据表明在神经元间、神经元与星形胶质细胞间都存在缝隙连接，而缝隙连接是钙信号传导的主要通路之一。在癫疒间的发生中，钙波的传导起到明显的作用，同时在慢性癫疒间模型中可以看到星形胶质细胞普遍增生，有文献表明GFRα-2受体也是GDNF的受体之一，而GFRα-2受体敲除小鼠又可以明显减少癫疒间的发作。更好地调控胶质细胞增生，调控钙信号从而控制癫疒间发作成为治疗的一个方向。研究报道GDNF基因治疗可以明显控制癫疒间发作［27］。这使GDNF将来用于治疗癫疒间成为可能，有望为临床带来更好的治疗前景。
5 问题与展望
GDNF作为近年来发现的一种新的广谱、高效能的神经营养因子，临床应用还不是很完善，对于其作用途径还需要进一步探究。大脑是人的高级中枢，脑血管疾病目前已经成为第一位致死致残疾病，脑血管病的二级预防尤为重要，如何使难以透过血脑屏障的GDNF进入脑内，如何更好地调控GDNF蛋白及其受体的分泌和高表达，从而发挥其保护作用成为目前研究的热点及重点。随着对亚低温的深入研究，许多研究已证实亚低温对缺血/再灌注损伤后脑组织具有明显的保护作用［28-29］，亚低温是否可以调控GDNF分泌以及受体的表达从而在中枢、周围神经系统疾病以及其他临床疾病的治疗中更好地发挥作用，仍需要进一步的探讨与研究。
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