作者：高超 ，刘颖，蔡晓敏，郝兴芝
【摘要】 目的 研究中药白花蛇舌草（Hedyotic diffusa，HD）对人宫颈癌Hela细胞端粒酶活性、细胞周期及凋亡的影响，以探讨HD抑制Hela细胞肿瘤活性与端粒酶的关系。方法 分别以不同的药物浓度作用于体外培养的Hela细胞，用PCR-TRAP-ELISA方法定量检测HD处理Hela细胞后其端粒酶活性水平，同步采用流式细胞仪检测细胞周期的变化及凋亡率。结果 Hela细胞端粒酶呈阳性，一定浓度的HD作用于Hela细胞一定时间后可使Hela细胞阻滞于S期，并可诱导其凋亡，而端粒酶活性明显降低。结论 HD可能通过改变Hela细胞周期分布（S期阻滞）并同时诱导细胞凋亡，下调其端粒酶活性而达到抗肿瘤作用。
【关键词】 白花蛇舌草；宫颈癌Hela细胞；细胞周期；凋亡；端粒酶
近年来一些学者对白花蛇舌草（Hedyotic diffusa，HD）的抗肿瘤作用进行了研究，其抗肿瘤作用基本得以肯定［1-4］，但对其作用机制尤其是分子生物学机制认识不深入。端粒酶的表达和细胞凋亡在肿瘤的发生和发展中起重要的作用，如何诱导肿瘤细胞凋亡和调节端粒酶的活性已成为肿瘤治疗的一条新途径。HD具有明显的体内外抗肿瘤作用，这种作用是否与引起肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞和端粒酶活性抑制有关，目前文献报道不多。本研究以人宫颈癌Hela细胞为研究对象，用PCR产物的聚丙烯酰胺电泳及银染定性检测端粒酶活性，PCR-TRAP-ELISA方法定量检测HD处理 Hela细胞后其端粒酶活性水平变化，同步采用流式细胞仪检测细胞周期的变化及凋亡率，以探讨HD抗肿瘤作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 Hela细胞培养
Hela细胞由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供，培养液为含10% 胎牛血清、100×103 U/L青霉素、0.1 g/L链霉素的RPMI 1640，用100 ml培养瓶，置5%CO2、37℃、饱和湿度的恒温箱中培养，细胞达80%～90% 融合状态时用0.25% 胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存，全部实验均用指数生长期细胞。
1.1.2 试剂
胎牛血清 (天津血液研究所)， 胰蛋白酶、核糖核酸酶(RNase)、碘化丙啶（PI）、PCR-TRAP-ELISA端粒酶活性检测试剂盒均购自华美生物工程公司。
1.1.3 药物
HD(江西天师中药集团余江制药厂)200 g加蒸馏水2 000 ml温火煎煮60 min，加热沸腾30 min ，网筛过滤去渣，滤液离心20 min，取上清液浓缩为200 ml，0.22 m过滤除菌，获1 kg/LHD提取液备用。
1.2 实验方法
1.2.1 药物处理
0.25% 胰酶消化后，用RPMI 1640培养液调细胞密度为1×108个/L，每培养瓶各加1 ml，再各加入培养液6 ml，置5% CO2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞生长达70%融合时更换培养液同时加入HD提取液，使药物终浓度为20、40、80 g/L，不同浓度培养相同时间。设加入等量培养液者为实验对照组。
1.2.2 流式细胞仪(FCM)分析 Hela细胞周期和凋亡
收集上述处理后的包括贴壁和悬浮的Hela细胞，用PBS调细胞密度为1×109个/L，取1 ml单细胞悬液，离心、漂洗，70%乙醇1 ml固定细胞，再用PBS漂洗，在单细胞样本中加入RNase，再加入终浓度为50 g/L的PI染色，过滤后用FCM测定。以正常人的外周血淋巴细胞为正常二倍体标准，根据测定的DNA组方图，用CELLQUEST分析软件分析Hela细胞的细胞周期和凋亡指数。
1.2.3 端粒酶活性检测
1.2.3.1 Bradford 法测定细胞提取液蛋白浓度
制作Bradford 法蛋白含量与光密度的标准曲线，根据波长595 nm下所测样品光密度（D），从标准蛋白曲线上读出样品提取液蛋白浓度。
1.2.3.2 PCR-TRAP银染定性检测
取20μl PCR产物混合物加入4 μl Ⅲ型凝胶上样缓冲液，同时设置端粒酶活性阳性及阴性对照，上样于12.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。将凝胶置于银染固定液中轻轻振荡30 min，水洗2～3次后将凝胶移入0.2%硝酸银染色液中，再将凝胶转入显色液（3%氢氧化钠、0.3%甲醛）中，直到棕黄色条带出现，置于5%乙酸终止液中，最后将凝胶放在保存液（10%甘油、2%乙醇）中浸泡60 min，UVP系统分析打印或干胶保存。
1.2.3.3 PCR-TRAP-ILISA法定量检测
取TRAP Tubes，各加入TRAP Mix 45 μl、细胞提取液2.0 μl (蛋白含量0.5～10 g)，混匀，上覆盖Paraffinliquid 30 μl，离心数秒，置25℃水浴中保温30 min，行 PCR扩增。取PCR产物25 μl，加入Hyb Reagent A 25 μl，混匀后，分别取25 μl加入到各孔中，混匀，设置端粒酶活性阳性及阴性对照，置37℃水浴中恒温反应60 min。每孔加入Chromogen A、Chromogen B各50 μl，37℃避光反应10 min，加入Stop Solution 100 μl，终止反应。酶标仪上波长450 nm下读取D值。样品D值大于或等于阴性对照D值的2.1倍时端粒酶活性为阳性。
1.3 统计学处理
应用SPSS 6.0统计软件进行统计分析，计量数据采用±s表示，组间差异采用t检验，检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 HD对Hela细胞周期和细胞凋亡的影响
随不同浓度HD提取液作用时间延长Hela细胞凋亡增多，G0/G1 细胞明显下降，S期细胞明显增多，而 G2/M细胞无明显变化。结果见表1。表1 流式细胞仪检测HD作用48 h Hela细胞周期和凋亡的结果(略)
2.2 HD对Hela细胞株端粒酶活性的影响
2.2.1 PCR-TRAP银染检测结果 Hela细胞株端粒酶表达阳性，为银染后出现6 bp间隔的棕黄色条带， 80 g/L浓度HD作用48 h后Hela细胞端粒酶仍呈阳性，但从电泳图上判断其活性下降。见图1。
2.2.2 PCR-TRAP-ELISA定量检测结果
20、40、80 g/L HD作用48 h后，端粒酶活性均有所下降。20 g/L的HD作用后，各时点与实验对照组比较均无显著性差异（P>0.05）；40 g/L和80 g/L的HD作用于Hela细胞48 h后端粒酶活性明显下降，与实验对照组比较有显著性差异（P<0.01）。见图2。对比PCR-TRAP银染检测结果，定量检测D值越高银染结果的条带数量越多、清晰度越高。
3 讨论
近年来在植物中寻找有效且副作用小的抗肿瘤药物已成为国内外重要的课题，关于中药抗肿瘤机制的研究方兴未艾。HD主要的化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、HD素等，研究结果显示HD具有一定的抗肿瘤活性，在体外对多种肿瘤细胞株具有增殖抑制作用［2-4］。流式细胞仪测到一定浓度的HD作用一定时间后Hela细胞可出现亚二倍体凋亡峰，80 g/L HD诱导Hela细胞凋亡率达21.34%，与实验对照组显示的自然凋亡率相比差异显著（P<0.01）。因此认为在一定剂量和时间范围内，HD可抑制Hela细胞生长，诱导Hela细胞凋亡可能是其机制之一。
研究表明，细胞增殖和凋亡在恶性肿瘤的发生上密切相关，阻断细胞增殖周期过程可引起凋亡，而凋亡常伴随有生长抑制，细胞增殖周期与细胞凋亡关系密切。有学者认为只有G0/G1期细胞才发生凋亡，但更多学者认为细胞周期各时相都可发生凋亡，不同处理因素及不同细胞株凋亡有不同的周期特异性［5］。细胞增殖需经过G1→S→G2→M 4个时期，任何时相生物合成被阻断均可导致细胞凋亡。本研究通过流式细胞仪对细胞增殖周期进行了分析，结果提示HD能使Hela细胞G0/G1 期细胞比例减少，S期细胞比例增多，表明HD使Hela细胞阻滞于S期，S期时相延长到一定时间后丧失增殖能力导致凋亡。这一结果提示临床上使用HD治疗恶性肿瘤的同时，可选用对S期敏感的药物进行联合化疗，提高治疗效果。
端粒酶是细胞RNA 依赖的DNA 聚合酶，能以其自身RNA 为模板逆转录合成端粒DNA，对维持端粒长度起重要作用，端粒酶的高表达及防止端粒短缩是促进癌组织克隆、繁殖、发展的基础。现已发现人类80%～90%的恶性肿瘤可以检测到端粒酶阳性，而大多数正常体细胞不表达端粒酶活性［6-8］。恶性肿瘤组织中端粒酶的高表达，使其具有更高的抗凋亡能力，一些化学物质诱导肿瘤细胞凋亡可能与其抑制细胞内端粒酶活性有关［9-11］。据统计，90%以上甚至高达100%的宫颈癌组织中可检测到端粒酶的表达。
本实验研究结果表明，一定浓度的HD在其诱导Hela细胞凋亡同时也伴随着端粒酶活性的下降，随着HD浓度升高和作用时间延长Hela细胞端粒酶活性呈下降趋势，而细胞凋亡呈上升趋势。结果提示，HD能下调细胞的端粒酶活性，Hela细胞的凋亡可能与HD下调端粒酶活性有关。深入研究两者的关系有助于进一步认识HD的抗肿瘤机制，并为抑制端粒酶活性诱导凋亡这一治疗恶性肿瘤的新途径提供理论依据，并有利于开发以抑制端粒酶活性和诱导细胞凋亡为靶点的抗肿瘤中药。
参考文献
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