作者：王春晴，李振宇 徐开林
【摘要】 目的 观察昆明山海棠(THH)提取物在急性移植物抗宿主病(aGVHD)中的作用及其可能的作用机制。方法 建立aGVHD模型，BALB/c受鼠清髓性预处理后分别用生理盐水、环孢素A(CsA)、THH及CsA+THH混合物灌胃。观察移植后受鼠aGVHD、生存时间、CD4+/CD8+比率、CD4+CD25+ T细胞比率及脾细胞Foxp3 mRNA水平。结果 生理盐水组出现典型aGVHD，20天内全部死亡。其余3组aGVHD临床、病理表现及生存时间均改善，组间无差异;CD4+/CD8+比率、受鼠CD4+CD25+ T细胞比率及脾Foxp3 mRNA表达较生理盐水组升高，以联用组明显。结论 THH可减轻小鼠aGVHD，延长其生存时间。机制可能与增加CD4+CD25+ T细胞比率，上调Foxp3 mRNA表达，调节CD4+/CD8+比率有关。THH和小剂量CsA联合有协同作用。
【关键词】 昆明山海棠;移植物抗宿主病;T细胞亚群;CD4+CD25+T细胞;Foxp3 mRNA
Abastract： Objective To observe the prophylactic effect of Tripterygium hypoglaucum Hutch (THH) extract on acute graft-versus-host disease (aGVHD) in mice following hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Methods 1×108 bone marrow cells mixed with 1×108 spleen cells from C57BL/6 mice were transplanted into the death irradiated BABL/c mice to establish the aGVHD model. Recipient mice were treated with 0.9% sodium chloride (group A)， ciclosporin A (group B)， THH extract (group C) and THH combined with CsA (group D). The signs of clinical aGVHD， histological evidence of aGVHD were assessed by survival， CD4+ and CD8+ T cell subsets， CD4+CD25+ subpopulation and the expression of Foxp3 in splenocytes after HSCT. Results The medium survival time for group A was 9 days and within 20 days after HSCT， all mice died， while that in groups B， C and D was over 30 days， which was significantly longer than in group A (P<0.05). Group A mice exhibited significant clinical symptoms and histological signs of aGVHD， whereas those of groups B， C and D showed only mild clinical and histological signs of aGVHD. The ratio of CD4+ T cells/CD8+ T cells， percentage of CD4+CD25+ T cells and the level of Foxp3 in the spleen in groups B， C and D were higher than group A， and group D showed the maximum effect.Conclusion THH can prevent aGVHD after allogeneic bone marrow transplantation in mice. The possible mechanism is involved in the upregulation of Foxp3 expression to induce CD4+CD25+ regulatory T cells and the regulation of the CD4+ and CD8+ T cells. THH combined with CsA showed synergic effect in the prevention of aGVHD.
Key words: Tripterygium hypoglaucum Hutch; graft-versus-host disease; T cell subsets; CD4+CD25+T cell; Foxp3 mRNA
异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是血液系统恶性疾病的治愈手段之一，移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是影响移植结果的主要障碍之一。预防GVHD常用的环孢素A(CsA)、他克莫司等免疫抑制剂不良反应大、费用高。昆明山海棠(THH)是一种中药免疫抑制剂，属于卫矛科雷公藤属植物，已应用于结缔组织病及自身免疫性疾病的治疗，具有肾上腺皮质激素类疗效，但不良反应小，停药后无反跳和戒断症状，且价格低廉。本研究将其用于小鼠急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)模型，并测定移植后受鼠体内T细胞亚群、CD4+CD25+T细胞及Foxp3 mRNA表达的变化，以评价其对GVHD的预防效果及可能的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物 受鼠为BALB/c小鼠(H-2Kd)，雌性;供鼠为C57BL/6小鼠(H-2Kb)，雄性，均为清洁级;鼠龄6～8周，体重18～22 g;购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)200320003，按二级动物标准运输、饲养。
1.2 药物和试剂 CsA(新赛斯平软胶囊，杭州中美华东制药有限公司生产)溶于无菌生理盐水，配制浓度为1 g/L。昆明山海棠片(0.25 g，广东博罗先锋药业集团有限公司)，溶于无菌生理盐水，配制浓度分别为40、20、10 g/L。小鼠抗H-2Kb单抗(BD公司);异硫氰酸荧光素-CD3(FITC-CD3)、藻红蛋白-CD4(PE-CD4)、藻红蛋白-CD8(PE-CD8)、异硫氰酸荧光素-CD25(FITC-CD25)单抗(eBioscience公司)。
1.3 aGVHD模型的建立 参照文献[1]方法无菌条件下制备骨髓细胞和脾细胞悬液，细胞密度均为1×1011/L。受鼠移植前行全身照射(TBI)，照射源为60Co γ射线，总剂量8.0 Gy，剂量率0.5 Gy/min。照射后4 h内尾静脉输入含2×107个骨髓细胞和2×107个脾淋巴细胞的混合细胞悬液，观察GVHD发生情况。
1.4 实验分组 BALB/c受鼠随机分4组，每组20只，每组受鼠均从移植前1天至移植后30天灌胃给药。A组生理盐水0.2 ml/d，B组CsA 10 mg/(kg·d)，C组THH 400 mg/(kg·d)，D组THH 100 mg/(kg·d)+CsA 5 mg/(kg·d)。
1.5 主要观察和检测指标
1.5.1 植入情况 采用流式细胞术检测移植后10 d、30 d受鼠骨髓细胞上异基因H-2Kb百分率。
1.5.2 观察指标 观察各组受鼠一般状况(如弓背、翘毛、腹泻等)、体重变化和生存时间(观察期30天)，小鼠濒死前取其四肢皮肤、肝和小肠行病理检查。
1.5.3 检测指标 移植后5、10、15、20、30天检测受鼠外周血CD4+/CD8+比率及CD4+CD25+T细胞比率，实时荧光定量PCR方法检测5、10、15、20、30天受鼠脾细胞内Foxp3 mRNA的表达水平。Foxp3上、下游引物分别为5′-CACAACATGGACTACTTCAAGTACCA-3′ 和5′-GGAATAGGCTACCCGGTAG-3′，荧光探针为5′-AATATGCGACCCCCTTTCACCTATGCC-3′，5′荧光素:FAM，3′淬灭剂:TAMRA，PCR产物75 bp。在7300型实时荧光定量PCR仪进行反应，反应条件:93℃ 2 min，然后93℃ 1 min，55℃ 1 min，共40个循环;采用外标法，标准品同前条件反应后制得标准曲线。由于每个反应管的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，即Ct值，与起始模板拷贝数的对数成反比的线性关系，因此可以通过Ct值来计算log( Foxp3 mRNA)，反映受鼠脾细胞内Foxp3 mRNA表达量的变化。
1.6 统计学处理 数据以±s表示，用Stata 7.0软件处理，组间比较采用单因素方差分析，生存时间比较采用Log-rank检验，等级资料采用秩和检验，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。
2 结 果
2.1 植入结果 本实验测得正常BALB/c小鼠白细胞计数为(9.90±2.09)×109/L。移植后3霜各组白细胞总数降至最低点;移植后5天渐有升高趋势，移植后15～20天白细胞总数基本恢复到6×109/L以上。+10天各组受鼠骨髓细胞表面H-2Kb分子百分率均>95%，+30天B、C、D组受鼠骨髓细胞表面H-2Kb分子百分率分别为(99.18±0.58)%、(97.68±0.59)%和(99.15±0.11)%。
2.2 各实验组受鼠移植后生存时间比较 A组受鼠移植后中位生存时间为9天，B、C、D组移植后中位生存时间均>30天(30天时的存活率分别为80%、75%和85%)。与A组相比，B、C、D组受鼠移植后生存时间明显延长(P<0.05)，而B、C、D组组间受鼠生存时间差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。
图1 实验组受鼠移植后Kaplan-Meier生存曲线比较
A组:对照组;B组:CsA组;C组:THH组;D组:CsA+THH联合组2.3 移植后各实验组受鼠aGVHD临床表现、病理组织学检查及嵌合体检测结果 A组受鼠全部在移植后5～14天出现典型的翘毛、弓背、腹泻、体重减轻等aGVHD表现，aGVHD病理表现为Ⅱ～Ⅲ级：①皮肤表皮层厚薄不均，真皮层有不同程度的血管扩张充血、水肿、炎性细胞浸润;②肝：胆小管上皮细胞肿胀、变性、胞核固缩，汇管区有充血、大量淋巴细胞和炎症细胞浸润;③小肠：小肠黏膜充血、水肿，固有层和肌层有淋巴细胞浸润，局部肠黏膜细胞坏死;20天内均死于aGVHD。B、C、D组aGVHD出现时间较A组均延迟，aGVHD发生率分别为30%、40%、30%，临床及病理表现较轻，以D组最轻。
2.4 移植后各组受鼠外周血CD4+/CD8+比率比较 表1显示，B、C、D组CD4+/CD8+比率均较A组升高(本实验测得正常BALB/c小鼠CD4+/CD8+比率为1.93±0.57)，D组升高最显著(与B组、C组比较，均P<0.05)。 表1 实验组移植后各时间点受鼠外周血CD4+/CD8+比率比较与A组比较：*P<0.05;与B组比较：△P<0.05;与C组比较：▲P<0.05
2.5 移植后各组受鼠外周血CD4+CD25+ T细胞比率比较 见图2。移植后第10天时B组、C 组和D组CD4+CD25+ T细胞比率开始增加，与A组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但B、C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05);第15天时B组、C组和D组CD4+CD25+ T细胞比率明显增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中D组升高最明显，其后依次为C组、B组;第20天时开始下降，D组下降较慢，与B组、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);第30天时D组CD4+CD25+ T细胞比率仍维持较高水平，高于B组、C组(P<0.05)。
2.6 移植后不同时间点各组受鼠脾细胞内Foxp3 mRNA表达比较 见表2。移植后第5天时B组、C组、D组受鼠脾细胞内Foxp3 mRNA表达水平均升高，C组、D组与A组比较差异有统计学意义(P<0.01);第10天、15天表达量进一步增加，此时间点B组、 C组、 D组较A组均明显升高(P<0.01)，D 组升高最明显(P<0.01)，3个用药组间比较差异均有统计学意义(P<0.01);各组均于移植后第15天时达高峰，之后逐渐下降，D组下降较缓慢，第30天时仍维持较高水平，与B组、C组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。表2 移植后不同时间点各实验组受鼠Foxp3 mRNA表达比较与A组比较：*P<0.01; 与B组比较：△P<0.01;与C组比较：▲P<0.01
3 讨 论
THH为卫矛科雷公藤属植物，二菇类和生物碱是其主要活性成分。杨录军等[2]报道THH提取物的急性毒性实验其治疗剂量与中毒剂量相距较大，且无蓄积性。因此本实验选择THH用于预防小鼠aGVHD，通过检测相关指标变化，观察THH预防aGVHD的作用并探讨其可能的机制。
我们选择C57BL/6、BALB/c小鼠异基因移植模型。结果表明受鼠移植后1周左右WBC>1×109/L，2周WBC>4×109/L。+10天和+30天进行嵌合体检测结果表明异基因骨髓细胞已植入。病理组织学检查发现对照组发生典型aGVHD，其余各组aGVHD临床和病理表现较轻，出现时间延迟，生存时间延长，THH组病理表现和生存时间与CsA组比较无统计学差异，说明THH对aGVHD有治疗作用;而THH与CsA联药组THH及CsA用量比单用CsA或THH组少，反而对GVHD的预防作用增强，说明THH和CSA联合应用有协同作用。
GVHD本质上是一种免疫应答过程，主要是T细胞介导的细胞免疫应答。CD4+ T细胞中大部分是CD4+辅助T细胞，激活的CD4+ T细胞分泌免疫应答发生必需的细胞因子，进而激活CD8+T细胞，使其成为细胞毒性T淋巴细胞，从而溶解供、受体细胞引发GVHD。有研究发现昆明山海棠能促进外周血CD4+ T细胞凋亡，也能诱导CD8+ T细胞凋亡[3]，本实验中发现应用THH后外周血中CD4+、CD8+ T细胞数下降，CD4+/CD8+细胞比率较治疗前上升并接近正常。临床上已采用THH治疗多发性硬化、重症肌无力患者，其结果均可使外周血CD4+/CD8+细胞比率较治疗前上升并接近正常，提示THH预防GVHD的作用机制可能主要在于抑制T淋巴细胞的免疫反应。
近几年在免疫耐受的探索中调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是研究的热点之一，已有研究表明Tregs能建立和维持对自身组成成分的免疫耐受，并且能通过负性调控控制针对非自身抗原的不同的免疫反应，CD4+ CD25+ Tregs是其中一个重要亚群[4]，与免疫耐受的诱导和维持有一定的关系[5-6]。
Tang等[7]报道发现5R-5-羟基雷公藤甲素预防小鼠GVHD与CD4+ CD25+ Tregs有关，THH中亦含有雷公藤甲素。Foxp3(foxhead /winged helix transcription factor)称叉头/翼状螺旋转录因子，属于foxhead家族成员，组成性表达于机体的CD4+ CD25+ Tregs。Khattri等研究发现Foxp3 mRNA的表达量与外周CD4+ Tregs功能有关。Miura等[3]研究证实Foxp3 mRNA表达与GVHD严重程度呈负相关。本实验结果显示，各组Foxp3 mRNA表达水平10天开始升高，15天达高峰，之后下降，同一时间点各组间比较差异有统计学意义。Foxp3 mRNA基本变化趋势和CD4+CD25+T细胞比率变化相一致。Foxp3可通过直接或间接抑制效应基因表达(如IL-2)，或作为一个转接蛋白招募其他具有抑制功能的效应分子与目的基因结合[8]，亦可通过抑制IL-4、IFN-γ上调TGF-β、IL-10等细胞因子的表达，参与免疫调节，进而发挥减轻GVHD的作用。THH减轻GVHD的机制可能与其增加CD4+ CD25+调节性T细胞比率，上调Foxp3 mRNA表达有关。
本研究结果表明，THH在异基因骨髓移植小鼠模型中有预防GVHD的作用，可能与调节CD4+/CD8+细胞、上调CD4+CD25+ T细胞比率和促进Foxp3 mRNA表达有关。THH和小剂量CsA联合应用可能有协同作用。
参考文献
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