【摘要】 目的 建立羧甲司坦的含量测定及有关物质检测的方法。方法 采用HPLC法，以C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）为色谱柱，以0.68%磷酸二氢钾和0.05%己烷磺酸钠（ph3.5）为流动相，检测波长为215 nm。结果 羧甲司坦在0.44～1.3 mg·mL-1范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系（r=0. 999 9），平均回收率为99. 5%，RSD为1.1%（n=9），最低检测限为 8.27 ng，各杂质峰与主峰达到基线分离。结论 本法简便、专属性及重现性好，可用于羧甲司坦含量及有关物质的测定。
【关键词】 羧甲司坦 反相高效液相色谱法 有关物质
羧甲司坦为半胱氨酸的巯基取代衍生物，2005年版中国药典收裁了该品种（含糖型），采用茚三酮显色比色法测定其含量［1］，也有文献报道采用HPLC蒸发光散射检测法［2］和柱前衍生荧光检测法［3］与反离子对色谱法［4］测定其含量和有关物质。本文采用反相离子对液相色谱法测定羧甲司坦的含量和有关物质，试验结果表明，该方法简便、专属性强、准确度高和重现性好。
1 仪器与试药
美国Agilent1100高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（DAD），ChemStation System 工作站。
羧甲司坦对照品（中国药品生物制品检定所），羧甲司坦口服溶液（无糖型，批号：051101、051102、051103， 规格：0.2 g/10 mL，由广州白云山制药总厂提供），己烷磺酸钠（分析纯，由Pure Chemical Analysis Co.，Ltd.提供），其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 含量测定
2.1.1 溶液的制备 对照品溶液的制备: 精密称取羧甲司坦对照品50 mg，置50 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1NaOH溶液5 mL，使溶解，并加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密量取本品适量，加水稀释制成每1 mL中约含羧甲司坦1 mg的溶液。
空白辅料溶液的制备：取辅料适量，按照处方配比，制成不含主药羧甲司坦的空白溶液。
2.1.2 色谱条件和系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：0. 68%磷酸二氢钾和0.05%己烷磺酸钠，用磷酸调pH值2.5；检测波长：215 nm；进样量：10 μL。理论塔板数按羧甲司坦计算为5 000，羧甲司坦峰与相邻峰的分离度符合规定，阴性对照无干扰。色谱图见图1。
A.羧甲司坦对照品;B.羧甲司坦无糖口服溶液供试品;C.阴性对照品 1．羧甲司坦
图1 羧甲司坦无糖口服溶液的HPLC谱图（略）
Figure 1 HPLC of chromatogram
2.1.3 线性试验 精密称取羧甲司坦对照品适量，置100 mL容量瓶中，加0.1 mol·L-1NaOH溶液5 mL，使溶解，加水稀释制成每1 mL中约含羧甲司坦2.2 mg的贮备液，分别精密量取适量，配制成系列浓度，按上述色谱条件测定，以羧甲司坦的质量浓度（ρ）对其相应的峰面积（A）作回归方程，结果在0. 44～1.3 mg·mL-1浓度范围呈良好的线性关系：A=1966.1ρ+16.771，r=0.999 9（n=6）。
2.1.4 精密度试验 取同一份对照品溶液，连续进样6次，结果峰面积和保留时间的RSD分别为0. 14%和0.45%，表明试验精密度良好。
2.1.5 重复性试验 精密量取羧甲司坦口服溶液适量，平行6份，分别测定含量，结果其RSD为0. 60%。
2.1.6 稳定性试验 制备供试品溶液，分别在0、2、4、6 h进样，6 h内测定结果的RSD为0.35%。
2.1.7 空白加样回收率试验 按处方比例制备空白对照液，分别加入3种比例的羧甲司坦对照液，按“2.1.2”项色谱条件进样测定回收率，结果平均回收率为99.5％，RSD为1.1%，见表1。
2.1.8 样品的测定 取供试品（批号 051101、051102、051103）按“2.1.1”项方法制备供试液，并按“2.1.2”项色谱条件进样测定，3批供试品的平均含量分别为101.1%、101.9%、101.4%。
2.2 有关物质测定
2.2.1 测定法 量取本品适量，加水稀释制成每1 mL中含羧甲司坦2 mg的溶液作为供试品溶液；精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；按“2.1.2”项下的色谱条件，取对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的30%；精密量取供试品溶液与对照溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
表1 羧甲司坦加样回收率试验结果（略）
Table 1 Results of recovery test
2.2.2 专属性 对照品溶液：精密称取羧甲司坦对照品50 mg，置50 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1NaOH溶液5 mL，使溶解，并加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
羧甲司坦+半胱氨酸溶液：用对照品溶液制成每1 mL含半胱氨酸0.5 mg的混合溶液。
酸水解产物：量取本品2 mL，置50 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1HCl溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀。
碱水解产物：量取本品2 mL，置50 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1NaOH溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀。
热分解产物：取本品1支，置沸水中加热10 min，冷却，量取2 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
强光破坏产物：取本品，在(4500±500)Lx下光照2 d后，量取本品2 mL，置50 mL量瓶中， 加水稀释至刻度，摇匀。
氧化降解产物：量取本品2 mL，置50 mL量瓶中，加过氧化氢0.1 mL，加水稀释至刻度，摇匀。
阴性对照液：取口服溶液的空白辅料适量，用水制成每1 mL含羧甲司坦1 mg的辅料溶液。
取上述溶液分别进样检测。色谱图见图2，有关物质测定结果见表2。
表2 有关物质测定结果（略）
Table 2 Results of the related substances determination
图2 降解产物的色谱图（略）
Figure 2 HPLC chromatogram of degradation products
2.2.3 最低检测限 羧甲司坦的最低检测限为 8. 27 ng。
2.2.4 不同pH值对产品稳定性的影响 用磷酸盐缓冲溶液配制pH值分别为5.5、5.9、6.5、7.0、7. 9、8.1的供试品溶液，按上述方法测定，结果见表3。
表3 不同pH值的试验结果（略）
Table 3 Results of stability at various pH values
3 讨论
3.1 羧甲司坦为强酸性化合物，分离强酸性化合物常用的离子对试剂是烷剂磺酸盐，经试验：流动相中以0.05%己烷磺酸钠为离子对时，保留时间约为5 min，杂质可达到基线分离，因此选择己烷磺酸钠作为离子对试剂。
3.2 从羧甲司坦对照品的二极管阵列检测器紫外扫描图看出，羧甲司坦有紫外末端吸收，因此检测波长选择215 nm。
3.3 有关物质专属性研究的图谱提示：（1）半胱氨酸是羧甲司坦合成的前体，羧甲司坦口服溶液在酸、碱、热、强光、氧化条件下被破坏产生的杂质并不是水解产物半胱氨酸；（2）本品在强酸、强碱性、热、强光、氧化破坏条件下，羧甲司坦口服溶液均产生保留时间为11.5 min的主杂质峰，推测可能为羧甲司坦的双分子聚合物，有待进一步证实。
3.4 pH值对供试品稳定性的影响试验结果表明：室温时，pH值对供试品溶液的含量和有关物质的影响不大；供试液经100 ℃加热15 min后，当pH值＞7.4时，有关物质明显增加，故羧甲司坦口服溶液生产制备时不宜采用高温消毒。
3.5 中国药典收载的羧甲司坦口服溶液（含糖型），有pH值降低现象，而无糖型产品经18个月的稳定性考察，溶液的pH值较稳定。
3.6 经方法学验证，本法简便、准确，灵敏度高，重复性好，可用于羧甲司坦无糖口服溶液的含量测定和有关物质检查。
参考文献
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版：一部［S］.北京:化学工业出版社，2005:817.
［2］ 陈秀琳，郑小力.HPLCELSD法测定羧甲司坦颗粒中羧甲司坦的含量［J］.中国药品标准，2006，7（3）:62-64.
［3］ 毕惠嫦，钟国平，汤铮，等.高效液相色谱法测定人血浆中羧甲司坦浓度［J］.中国医院药学杂志，2005，25(9):828-830.
［4］ 赵雪梅，黄秀明.反相离子对色谱法测定羧甲司坦片和口服溶液中羧甲司坦的含量［J］.中国药品标准，2007，8（2）:60-63.