作者：洪建文 李趣嫦 王彦蝶
【摘要】 目的 建立阿莫西林颗粒剂中阿莫西林的含量测定及有关物质检查的方法。方法 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH值5.0）乙腈（体积比97.5∶2.5）为含量测定的流动相；以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH值5.0）乙腈（体积比99∶1）为流动相A， 0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（pH5.0）乙腈（体积比80∶20）为流动相B，梯度洗脱检查有关物质，检测波长230 nm，柱温30 ℃，流速 1.0 mL/min。结果 阿莫西林分别在0.1～1 mg/mL(r=0.999 9，n=7)与0.049～0.0012 mg/mL(r=0.999 8，n=5)范围内与峰面积线性关系良好，低、中、高3个浓度的回收率分别为100.2%、99.8%和100.0%(RSD=0.2%，n=9)。阿莫西林有关物质检查的检测限为2 ng，且主成分与有关杂质均能有效分离。结论 本文建立的含量测定方法快速、准确、重现性好，有关物质检查方法专属、灵敏，可用于阿莫西林颗粒剂的质量控制。
【关键词】 阿莫西林颗粒剂 含量测定 有关物质 高效液相色谱法
阿莫西林颗粒剂是香港联邦制药厂有限公司产品，是广谱半合成青霉素类抗生素，具有疗效好、不易致过敏等优点，广泛应用于儿童呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统感染。阿莫西林颗粒剂现行质量标准为进口药品注册标准。该标准采用选择性较差，影响因素较多，试剂配制繁杂且有一定毒害，操作步骤也较繁琐的紫外分光光度法进行含量测定，未进行有关物质的检查。该制剂在《国家药品标准》化学药品地方标准第二册中有收载，也未进行有关物质检查。作为儿童药品，为了更好地控制本产品质量，提高进口注册标准，保证产品的疗效，本文采用高效液相色谱法［1-4］对阿莫西林颗粒剂中阿莫西林的含量及有关物质进行研究，建立了快速、准确、重现性好的含量测定方法及专属、灵敏的有关物质检查方法，可更好用于本品的质量控制。
1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪，Agilent1200高效液相色谱仪，Sartorius BP211D万分之一电子天平。
阿莫西林对照品（中国药品生物制品检定所，批号为130409200609，纯度为86.6%，供含量测定用），阿莫西林颗粒剂（香港联邦制药厂有限公司，批号为17345、17374、17146、17155，规格：0.125 g/包），乙腈（色谱纯），磷酸二氢钾、氢氧化钾、氢氧化钠（分析纯），水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 检测波长的选择
取样品适量，加流动相溶解并稀释，在波长200～300 nm之间进行紫外扫描，结果阿莫西林在230 nm波长处有最大吸收，同时杂质在230 nm也有较大响应。因此选择230 nm为本法的检测波长。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（用2 mol/L的氢氧化钾调节pH值至5.0）乙腈（体积比97.5∶2. 5）为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为230 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。色谱结果见图1。
A.对照品;B.样品
图1 阿莫西林颗粒剂含量测定的HPLC色谱图（略）
Figure 1 HPLC of amoxicillin
2.2.2 溶液的制备 对照品溶液：精密称取阿莫西林对照品适量，加流动相制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。
供试品溶液：取装量差异项下的内容物，研细，精密称取粉末适量，加流动相溶解并定量稀释成每1 mL含0.5 mg的溶液，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 专属性试验 取空白辅料按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明空白辅料对样品测定无干扰。将供试品在60 ℃温度下放置10 d，于第10天取样，按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明本品经高温加速实验后，杂质总数和总量均有所增加，主成分与各种分解产物完全分离。将供试品在相对湿度92. 5%（KNO3饱和溶液），温度35 ℃下放置10 d，于第10天取样，按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明本品经高湿加速实验后，杂质总数和总量均有所增加，主成分与各种分解产物完全分离。色谱图见图2。
A.空白辅料;B.高温降解;C.高湿降解;1.阿莫西林
图2 阿莫西林专属性试验HPLC色谱图（略）
Figure 2 HPLC of amoxicillin for selectivity test
2.2.4 线性关系考察 精密称取阿莫西林对照品适量，用流动相溶解并稀释成含阿莫西林0.099 47、0.198 9、0.397 9、0.497 3、0.596 8、0.795 8、0.994 7 mg/mL的溶液，按“ 2.2.1”项下的色谱条件进行测定，以质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，得线性回归方程为A=29328ρ-6.7868，r=0. 999 9（n=7）。结果表明，阿莫西林质量浓度在0.1～1 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
2.2.5 精密度试验 取同一批供试品（批号17374）1份，按“ 2.2.1”项下的色谱条件连续进样5次，其峰面积的平均值为16025.6，RSD为0.04%（n=5），表明方法精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于配制后0～8 h内按“ 2.2.1”项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，结果阿莫西林的峰面积RSD为0. 1%，表明溶液在8 h内稳定。
2.2.7 重复性试验 取同一批样品（批号17374）6份，分别按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定，计算得阿莫西林的平均含量为104.1%，RSD为0.6%（n=6），表明分析方法重复性良好。
2.2.8 回收率试验 称取空白辅料，分成9等份，3份为１组，分别精密加入一定量的阿莫西林对照品，充分混合均匀，置50 mL量瓶中，按“2.2.2”项方法制备溶液，进样测定，计算回收率。结果阿莫西林平均回收率为100.0%，RSD=0.2%，表明本方法准确可靠。
2.2.9 检测限 在“2.2.1”项的色谱条件下，当阿莫西林对照品进样浓度为0.05 μg/mL时，记录的色谱峰峰高约为基线噪音3倍，根据进样量20 μL计算，阿莫西林的检测限为1 ng。
2.3 有关物质
2.3.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（用2 mol/L的氢氧化钾调节pH值至5.0）乙腈（体积比99∶1）为流动相A，0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 5.0）乙腈（体积比80∶20）流动相B，先以流动相A流动相B(体积比92∶8)等度洗脱，待阿莫西林峰洗脱完毕后按以下程序进行线性洗脱（见表1），流速为1.0 mL/min；检测波长 230 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。色谱分离结果见图3。
表1 线性梯度洗脱（略）
Table 1 Gradient elution
2.3.2 溶液的制备 对照品溶液：精密称取阿莫西林对照品，加流动相A制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。
供试品溶液：取装量差异项下的内容物，研细，精密称取粉末适量，加流动相A溶解并稀释成每1 mL含2 mg的溶液，滤过，取续滤液，即得。
A.对照品;B.样品;C.空白辅料;1.阿莫西林
图3 阿莫西林颗粒剂有关物质测定的HPLC色谱图（略）
Figure 3 HPLC of amoxicillin and impurities
2.3.3 专属性试验
将供试品在60 ℃温度下放置10 d，于第10天取样，按“2.3.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明本品经高温加速实验后，杂质总数和总量均明显增加，主成分与各种分解产物完全分离。将供试品在相对湿度92.5%（KNO3饱和溶液），温度35 ℃下放置10 d，于第10天取样，按“2.3.2”项方法制备溶液，进样测定。结果表明本品经高湿加速实验后，杂质总数和总量均有所增加，主成分与各种分解产物完全分离。色谱图见图4。
A.高温降解;B.高湿降解;1 阿莫西林
图4 阿莫西林专属性试验HPLC色谱图（略）
Figure 4 HPLC of amoxicillin for selectivity test
2.3.4 线性关系考察 精密称取阿莫西林对照品适量，用流动相溶解并稀释成含阿莫西林0.049 7、0.024 8、0.012 4、0.006 2、0.001 2 mg/mL的溶液，按“2.3.1”项下的色谱条件进行测定，以质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，得线性回归方程为A=29328ρ-6.6772，r=0.999 8（n=5）。结果表明，阿莫西林质量浓度在0.049～0.001 2 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
2.3.5 重复性试验 取同一批样品（批号17374）6份，按“2.3.2”项方法制备溶液，进样测定，计算得单个最大杂质含量为0.53%，RSD为2.1%，总杂质含量为1.2％，RSD为2.0%（n=6），表明分析方法重复性良好。
2.3.6 检测限 在“2.3.1”项的色谱条件下，当阿莫西林对照品进样质量浓度为0.1 μg/mL时，记录的色谱峰峰高约为基线噪音3倍，根据进样量20 μL计算，得阿莫西林的检测限为2 ng。
2.4 样品测定
按拟定的方法测定4批样品中阿莫西林的含量，结果见表2。
表2 含量与有关物质测定结果 （略）
Table 2 Contents and related substance of amoxicillin
3 讨论
3.1 取3批样品同时采用原标准的UV法和本文的HPLC法进行含量测定，结果见表3。结果表明HPLC法测得的含量均小于UV法，可能是因为HPLC法选择性好，能将阿莫西林与相似结构杂质分离，因此表明采用HPLC法可更专属、快速地测定阿莫西林颗粒剂中阿莫西林的含量。
表3 2种含量测定方法的比较（略）
Table 3 Contents of amoxicillin by two methods
3.2 分别对刚生产及存放1年后产品进行有关物质考察比较，结果单个最大杂质含量由0.23％增加为0.53％，总杂质含量由0.44％增加为1.14％，说明对阿莫西林颗粒有关物质的检查是非常必要的。
3.3 分别选用色谱柱Thermo ODS C18 （200 mm×4.6 mm，5 μm）、Tigerkin C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）、SHIMADZU ODS C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm），取同一批样品分别进行试验，结果3种色谱柱理论塔板数均达到2 000以上，主峰与各杂质的分离度均符合要求，测定结果重现性好。
3.4 本文建立了专属、灵敏、快速、准确的阿莫西林颗粒剂的含量测定及有关物质检查的方法，可以更好的控制该药品的质量。本文结果提示这种主要用于儿童的药品，对其进行有关物质检查十分必要。
参考文献
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