洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比较

　　　　　　 作者：黄欣 朱碧云 吕带弟 陈伟立 黄晓琳 李浩明

【摘要】 目的 克隆红曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH，并进行序列分析和同源性比较。方法 根据GeneBank土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因序列设计引物，以土曲霉和红曲霉基因组DNA为模板PCR扩增lovE和mkH基因并克隆到pMD19T simple载体。利用DNAMAN等软件以及互联网资源对lovE和mkH测序结果与其编码的氨基酸序列进行分析比对。结果 分别扩增得到1 512 bp和1 464 bp的目的片段lovE和mkH。结论 lovE和mkH同源性很高，并与GeneBank中相关已知序列基本相同，是洛伐他汀生物合成酶调控基因，且其表达产物为GAL4类转录因子。

【关键词】 土曲霉 红曲霉 洛伐他汀 转录因子 调控基因

洛伐他汀是胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一［1-3］，它可下调炎症相关转录因子的表达，减缓动脉粥样硬化［4，5］，并可促进恶性甲状腺细胞凋亡［6，7］，具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能［8］。
　　 　　
　　土曲霉洛伐他汀合成酶基因簇包括lovAlovG以及lovI和lvrA等基因［9-11］。红曲霉洛伐他汀合成酶基因簇包括mkAmkI等9个基因。其中lovE和mkH分别是土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物合成的调控基因，编码GAL4类转录因子，其氨基酸序列中半胱氨酸富集的DNA结合区域表明含有Zn2Cys6型锌指结构域［12-14］。为深入研究洛伐他汀生物合成调控基因的生物学功能并利用这类转录因子来调控洛伐他汀合成代谢，本研究首次从国内常用工业原始出发菌株土曲霉CCTCC AF93208和红曲霉CICC5031基因组中PCR扩增克隆洛伐他汀合成酶调控基因，并对该基因和其编码的蛋白产物进行序列分析对比。　　

　　1　　实验材料

　　1.1　　菌株和培养基
　　 　　
　　土曲霉（Aspergillus terrus）CCTCC AF93208：中国典型培养物保藏中心;红曲霉（Monascus anka）CICC 5031：中国工业微生物菌种保藏中心;大肠杆菌DH5α为本实验室保藏;大肠杆菌LB培养基和LB/Amp培养基均按实验室常用培养基的配置方法配置。
　　 　　
　　斜面培养基［15］（g/L）：察氏培养基（蔗糖 30 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7h3O 0.5 g，KCl 0. 5 g，FeSO4·7h3O 0.01 g，琼脂 15 g，纯净水 1 000 mL）。
　　 　　
　　菌丝生长培养基［15］（g/L）：葡萄糖 50 g，酵母膏 10 g，番茄酱 20 g，CaCO3 1 g，pH 7.2～7.5。

　　1.2　　试剂
　　 　　
　　PCR引物由英俊生物技术有限公司合成。Taq酶采用fermentas的Taq recombinant。OMEGA的胶回收试剂盒D250101。Takara公司的pMD19T simple克隆载体。Takara公司的DNA Marker DL2000和100 bp ladder。其他常规化学试剂均为国产分析纯。

　　2　　实验方法

　　2.1　　培养方法
　　 　　
　　用2 mL无菌水冲洗孢子，接入固体斜面培养。固体斜面培养7 d后，以5 mL水洗下，稀释至浓度为107个/mL，取2 mL加入100 mL菌丝生长培养基，转速150 r/min，28℃培养4 d。

　　2.2　　基因组DNA提取
　　 　　
　　过滤取菌丝球（尽量吸干），称重并转入-20℃预冷的研钵。每克菌丝球加入3 g石英砂，0.4 mL提取液［100 mmol/L TrisHCl(pH8.0)，20 mmol/L Na2EDTA，0.5 mol/L NaCl，1% SDS］，0.5 mL有机液（酚/氯仿/异戊醇 （体积比）25∶24∶1）。将上述混合物于预冷研钵中剧烈研磨1 min直到成黏稠状细粉。每克菌丝球再加入4 mL提取液，2 mL有机液，充分混匀。用已剪枪头吸转至1.5 mL EP管，室温16 000 g离心5 min。吸转水相到新管，加0.6倍体积异丙醇，室温静置10 min，4 ℃16 000 g离心15 min，弃废液。95%乙醇润洗沉淀，稍微风干。加340 μL重溶液1［10 mmol/L TrisHCl(pH8.0)，1 mmol/L Na2EDTA，20 μg/mL RNaseA］，37℃水浴30 min。按前比例有机液再抽提一次，300 μL水相转新管。加入0.5倍体积7.5 mol/L乙酸铵溶液和2. 5倍体积95%乙醇均匀混合，-20℃静置30 min，4℃16 000 g离心15 min，弃废液。95%乙醇润洗沉淀，风干。每管加入100 μL重溶液2［10 mmol/L TrisHCl(pH8.0)，1 mmol/L Na2EDTA］，-20 ℃保存［16］。

　　2.3　　PCR引物设计
　　 　　
　　根据GeneBank上公布的土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物合成基因簇（登录号为AF141925和DQ176595）中lovE和mkH基因设计如下引物扩该基因。lovEF: ATGGCTGCAGATCAAGGTATAT；lovER: TCATGGAGGAATATTGTTGAGG；预期lovE产物大小为1 512 bp。mkHF: TTAGGAGGCCAGGTTGTGTTGG；mkHR: ATGGCCCTATCGCCAGTCCAGG；预期mkH产物大小为1 464 bp。

　　2.4　　PCR反应
　　 　　
　　反应体系：10×buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1. 2 μL，10 μmol/L dNTPs 0.4 μL，20 μmol/L 引物组各0.4 μL，ddh3O 14.5 μL，DNA 1 μL，Taq酶 0.1 μL。总体系20 μL。
　　 　　
　　热循环条件：94 ℃预变性5 min后，以94 ℃30 s，50 ℃20 s，72 ℃1 min 40 s程序循环40次，延伸72 ℃20 min。

　　2.5　　目的片段的克隆与测序
　　 　　
　　1%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再按胶回收试剂盒操作回收纯化PCR产物。按pMD19T simple载体1 μL，回收DNA4 μL，solutionⅠ（含T4连接酶和连接酶缓冲液）5 μL的比例轻轻打匀于16 ℃水浴连接2 d。大肠杆菌DH5α感受态制备及转化均按分子克隆指南方法操作。克隆片段交由英俊生物技术有限公司双脱氧法双向测定并拼接。

　　2.6　　转化子验证
　　 　　
　　蓝白斑筛选挑取白斑单克隆菌落PCR验证。
　　 　　
　　反应体系：10×buffer 1 μL，25 mmol/L MgCl2 1. 2 μL，10 μmol/L dNTPs 0.2 μL，20 μmol/L 引物组各0.2 μL，ddh3O 7.15 μL，DNA 无菌枪头蘸取，Taq酶 0.1 μL。总体系10 μL。
　　 　　
　　热循环条件：94℃预变性5 min后，以94 ℃30 s，50 ℃20 s，72 ℃1 min40 s程序循环30次，延伸72 ℃ 5 min。

　　2.7　　序列分析比对
　　 　　
　　采用DNAMAN软件将测序结果与GeneBank已知序列进行比对，并通过NCBI等网络资源分析基因序列及其对应蛋白的理化性质、高级结构和功能。

　　3　　结果与分析

　　3.1　　PCR扩增结果
　　
　　见图1，表明对lovE和mkH扩增得到与预期大小一致的产物，约为1 500 bp。

　　M为DNA Marker DL2000（从上至下分别是2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；0为阴性对照即没加模

　　图1　　PCR扩增结果（A为lovE，B为mkH）（略）

　　Figure 1　　Electrophoresis of PCR products on 1% agarose gel（A for lovE and B for mkH）

　　3.2　　菌落PCR验证结果
　　
　　见图2，对lovE和mkH扩增得到了与预期大小一致的产物，约为1 500 bp。

　　A图中M为DNA marker 100 bp ladder（从上至下分别是1 500 bp，1 000 bp，900 bp，800 bp，700 bp，600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp）；B图中M为DNA Marker DL2000（从上至下分别是2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；0为阴性对照即没加模板DNA；A图中1-9是lovE的菌落PCR扩增结果；B图中1-6是mkH的菌落PCR扩增结果

　　图2　　菌落PCR结果（A为lovE，B为mkH）（略）

　　Figure 2　　Electrophoresis of colony PCR products on 1% agarose gel（A for lovE and B for mkH）

　　3.3　　扩增片段测序结果及分析

　　3.3.1　　核苷酸及氨基酸分析　　将重组菌种交英俊生物技术有限公司测序，lovE的3次测序结果与GeneBank中lovE通过DNAMAN比对仅在第614位碱基处由C置换了T，编码的氨基酸也仅在第205位氨基酸处由Ala置换了Val；而mkH的3次测序结果与GeneBank中mkH完全一致。由此可见两者之间的差异可能是个体多态性，也证明了洛伐他汀合成酶调控基因种间保守程度极高。

　　将测序结果提交到GeneBank中进行blastn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）比对，lovE和mkH分别与GeneBank中登录号为AF141925.1和DQ176595.1(分别编码Aspergillus terrus调控蛋白和Monascus pilosus转录因子)的相似性达到99. 9%和100%，表明克隆片段应为洛伐他汀合成酶调控基因。且lovE基因长1 512 bp，编码503个氨基酸，不含内含子结构；而mkH基因长1 464 bp，编码455个氨基酸，且含有一长为96 bp的内含子。
　　 　　
　　将两基因的测序结果递交DNAMAN软件进行同源性分析比对，两基因相似性较高（核酸序列一致性identity达到67.92%），而将其对应编码的氨基酸序列比对，氨基酸序列一致性identity达到60. 59%，说明了洛伐他汀合成酶调控基因在属间也具有较高的同源性和保守程度。BLASTn比对中得知存在高度相似性（identities分别为67%和74%）。
　　 　　
　　测序结果的氨基酸序列提交到SWISSPROT数据库通过实用ProtParam程序（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）输出lovE蛋白情况如下：氨基酸数503；分子量55427.3 Da；分子式C2394H3799N709O757S25；原子总数7 684；理论等电点6.08；脂肪族指数75.31；总平均疏水性-0.397。而mkH蛋白情况如下：氨基酸数455；分子量49305.6 Da；分子式C2139H3394N618O673S24；原子总数6 848；理论等电点5.86；脂肪族指数78.29；总平均疏水性-0.296。

　　3.3.2　　亚细胞定位分析　　亚细胞定位研究（http://psort.nibb.ac.jp & http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）表明lovE和mkH蛋白未显示典型的N端信号肽区域，SubLoc分别以84%，94%的精确度和RI=3，5的可靠性指数预测两蛋白在核内。SignalP分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测结果显示两蛋白均非分泌蛋白，且存在信号肽的可能性分别为10.4%和0。

　　3.3.3　　疏水性分析　　疏水和亲水是氨基酸固有的特性，蛋白质结构的特征是疏水和亲水间的平衡，其结构的稳定在很大程度上有赖于分子内的疏水作用。疏水性预测和分析对于蛋白质次级结构的预测及功能分析都有较为重要的参考意义。将测序结果递交到服务器http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl采用kyte和Doolittle的方法得出两蛋白大部分氨基酸是亲水的，因此属于亲水蛋白。这也和signalP以及亚细胞定位分析预测结果一致为核内的非分泌蛋白，蛋白通过核孔复合体进入核内需要亲水基团的参与。

　　3.3.4　　蛋白高级结构及功能分析　　蛋白质通常含有一些结构域和特殊的保守位点，而这样的结构涉及某种进化起源或者负责特殊的功能。将测序结果递交到自动比较同源蛋白建模服务器SWISS (http://swissmodel.expasy.org/SWISSMODEL.html)及PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)对lovE和mkH编码氨基酸序列进行高级结构分析。再通过VAST Search Structure（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html）分析上述获得的pdb文件，其结果用Cn3D软件如图3所示：

　　图3　　蛋白高级结构分析（A为lovE蛋白，B为mkH蛋白）（略）

　　Figure 3　　Advanced structure analysis（A for lovE protein and B for mkH protein）　　

　　图3中两蛋白均具有Zn2Cys6双核簇合物的锌指结构DNA结合结构域，该保守结构域发现于如GAL4型的转录因子，曾在酿酒酵母中证实GAL4为半乳糖诱导的基因表达正调控子。此结构域由2个α螺旋环绕成富集半胱氨酸的锌指基序（参与Zn依赖性的DNA结合）并由无规则卷曲串联起来。该类结构域还涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸盐、麦芽糖和半乳糖的代谢，以及酰胺和α氨基丁酸的降解与亮氨酸的生物合成等。

　　4　　讨论
　　 　　
　　洛伐他汀是目前治疗高血脂症的常用药物之一。国内工业化生产洛伐他汀的效率并不理想，以致研究者们纷纷以增产洛伐他汀为目标开展多方面的研究。目前从基因工程方面着手改善其产量成为热点。本文克隆的lovE和mkH基因编码产物是一个洛伐他汀生物合成的调控蛋白或转录因子，对其深入研究将有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。
　　 　　
　　Kennedy、Park等将lovE基因突变失活导致检测不到任何洛伐他汀中间产物，同时将一个额外拷贝的lovE转化土曲霉，洛伐他汀产量增加5～7倍［10，16］。从上述数据可以看出对lovE和mkH基因以及其编码蛋白的结构功能的进一步研究将为深入理解洛伐他汀生物合成及其遗传调控方面提供参考，且为进一步表达基因、纯化相关蛋白、制备多克隆抗体、研究基因体外转录、转录因子与DNA的体外模拟结合以深入了解该类转录因子生物学功能和作用机理奠定了实验基础。
　　 　　
　　本研究利用国际互联网生物信息学资源，通过计算分析两蛋白物理化学特性，得知此两核蛋白和一些转录因子以及调控序列编码产物有共同的GAL4类锌指结构保守序列区。相似性搜索比对得知lovE和mkH不论基因还是编码产物序列都具有高度相似性，存在共同的DNA结合保守序列。

参考文献

　　［1］ AUER J， EBER B. A clinical focus on statins［J］. Curr Opin Investig Drugs， 2001， 2(3):382-388.

　　［2］ YOON N Y， KIM H R， CHUNG H Y， et al. Antihyperlipidemic effect of an edible brown algae， Ecklonia stolonifera， and its constituents on poloxamer 407induced hyperlipidemic and cholesterolfed rats［J］. Arch Pharm Res， 2008， 31(12):1564-1571.

　　［3］ SANDHYA V G， RAJAMOHAN T. Comparative evaluation of the hypolipidemic effects of coconut water and lovastatin in rats fed fatcholesterol enriched diet［J］. Food Chem Toxicol， 2008， 46(12):3586-3592.

　　［4］ DICHTL W， DULAK J， FRICK M， et al. HMGCoA reductase inhibitors regulate inflammatory transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2003， 23(1): 58-63.

　　［5］ MUSUNURU K， BLUMENTHAL R S. The implications of the ezetimibe and simvastatin in hypercholesterolemia enhances atherosclerosis regression trial: a return to first principles［J］. Clin Cardiol， 2008， 31(6):288-290.

　　［6］ ZHONG W B， WANG C Y， CHANG T C， et al. Lovastatin induces apoptosis of anaplastic thyroid cancer cells via inhibition of protein geranylgeranylation and de novo protein synthesis［J］. Endocrinology， 2003， 144(9): 3852-3859.

　　［7］ LAEZZA C， FIORENTINO
　　 　　
　　将测序结果提交到GeneBank中进行blastn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）比对，lovE和mkH分别与GeneBank中登录号为AF141925.1和DQ176595.1(分别编码Aspergillus terrus调控蛋白和Monascus pilosus转录因子)的相似性达到99. 9%和100%，表明克隆片段应为洛伐他汀合成酶调控基因。且lovE基因长1 512 bp，编码503个氨基酸，不含内含子结构；而mkH基因长1 464 bp，编码455个氨基酸，且含有一长为96 bp的内含子。
　　 　　
　　将两基因的测序结果递交DNAMAN软件进行同源性分析比对，两基因相似性较高（核酸序列一致性identity达到67.92%），而将其对应编码的氨基酸序列比对，氨基酸序列一致性identity达到60. 59%，说明了洛伐他汀合成酶调控基因在属间也具有较高的同源性和保守程度。BLASTn比对中得知存在高度相似性（identities分别为67%和74%）。
　　 　　
　　测序结果的氨基酸序列提交到SWISSPROT数据库通过实用ProtParam程序（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）输出lovE蛋白情况如下：氨基酸数503；分子量55427.3 Da；分子式C2394H3799N709O757S25；原子总数7 684；理论等电点6.08；脂肪族指数75.31；总平均疏水性-0.397。而mkH蛋白情况如下：氨基酸数455；分子量49305.6 Da；分子式C2139H3394N618O673S24；原子总数6 848；理论等电点5.86；脂肪族指数78.29；总平均疏水性-0.296。

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　　3.3.4　　蛋白高级结构及功能分析　　蛋白质通常含有一些结构域和特殊的保守位点，而这样的结构涉及某种进化起源或者负责特殊的功能。将测序结果递交到自动比较同源蛋白建模服务器SWISS (http://swissmodel.expasy.org/SWISSMODEL.html)及PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)对lovE和mkH编码氨基酸序列进行高级结构分析。再通过VAST Search Structure（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html）分析上述获得的pdb文件，其结果用Cn3D软件如图3所示：

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　　Figure 3　　Advanced structure analysis（A for lovE protein and B for mkH protein）　　

　　图3中两蛋白均具有Zn2Cys6双核簇合物的锌指结构DNA结合结构域，该保守结构域发现于如GAL4型的转录因子，曾在酿酒酵母中证实GAL4为半乳糖诱导的基因表达正调控子。此结构域由2个α螺旋环绕成富集半胱氨酸的锌指基序（参与Zn依赖性的DNA结合）并由无规则卷曲串联起来。该类结构域还涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸盐、麦芽糖和半乳糖的代谢，以及酰胺和α氨基丁酸的降解与亮氨酸的生物合成等。

　　4　　讨论
　　 　　
　　洛伐他汀是目前治疗高血脂症的常用药物之一。国内工业化生产洛伐他汀的效率并不理想，以致研究者们纷纷以增产洛伐他汀为目标开展多方面的研究。目前从基因工程方面着手改善其产量成为热点。本文克隆的lovE和mkH基因编码产物是一个洛伐他汀生物合成的调控蛋白或转录因子，对其深入研究将有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。
　　 　　
　　Kennedy、Park等将lovE基因突变失活导致检测不到任何洛伐他汀中间产物，同时将一个额外拷贝的lovE转化土曲霉，洛伐他汀产量增加5～7倍［10，16］。从上述数据可以看出对lovE和mkH基因以及其编码蛋白的结构功能的进一步研究将为深入理解洛伐他汀生物合成及其遗传调控方面提供参考，且为进一步表达基因、纯化相关蛋白、制备多克隆抗体、研究基因体外转录、转录因子与DNA的体外模拟结合以深入了解该类转录因子生物学功能和作用机理奠定了实验基础。
　　 　　
　　本研究利用国际互联网生物信息学资源，通过计算分析两蛋白物理化学特性，得知此两核蛋白和一些转录因子以及调控序列编码产物有共同的GAL4类锌指结构保守序列区。相似性搜索比对得知lovE和mkH不论基因还是编码产物序列都具有高度相似性，存在共同的DNA结合保守序列。

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