肺结核性及腺癌性胸水SDSPAGE蛋白图谱分析

【摘要】 目的 分析肺结核性及腺癌性胸水SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE )图像之图谱特点及异同，为两者的鉴别诊断奠定基础。方法 选用28例肺结核性胸水及36例肺腺癌性胸水，每例均以5%浓缩胶和不同浓度（6%、8%、10%、12%、15%）之分离胶行SDSPAGE分离胸水中蛋白质，考马斯亮蓝染色，AlphaEaseFC Stand Alone图像分析软件分析10%分离胶凝胶图像。结果 不同浓度（6%、8%、10%、12%、15%）的分离胶SDSPAGE图像表明， 肺结核性胸水及肺腺癌性胸水经10%SDSPAGE分离，两者的胸水蛋白在40～200 kD范围内均可稳定分离得到10条蛋白条带。这些条带蛋白质分子量分别为200 kD、152 kD、134 kD、118 kD、103 kD、98 kD、84 kD、62 kD、54 kD、43 kD。含量达60%以上的蛋白质分子量在54 kD至84 kD之间。50～60 kD区间的蛋白质含量肺结核性胸水高于肺腺癌性胸水，差异具有显著性。结论 10%及12%的分离胶对胸水中的蛋白具有较好的分离效果；经10%的分离胶分离，肺结核性胸水分子量在50～60 kD区间内的蛋白含量高于肺腺癌性胸水，具有鉴别诊断价值。

【关键词】 SDSPAGE 蛋白 肺癌 肺结核 胸水 图像分析

肺结核及肺腺癌是临床上引起胸水的两种常见疾病［1-5］。目前，有近20%的结核性和癌性胸水在临床经全面检查后仍难以鉴别［6］，因而影响疾病的治疗。由于结核性和癌性胸腔积液的治疗及预后有很大的差别， 因此两者的鉴别至关重要。胸水蛋白SDSPAGE图谱的图像分析尚未见报道。为探讨肺结核性及腺癌性胸水SDSPAGE蛋白图谱分析的诊鉴价值，笔者进行了研究。

　　1　　材料与方法

　　1.1　　研究对象
　　
　　收集南方医院2007年7月至2008年7月的肺结核性胸水28例及肺腺癌性胸水36例。其中男性33 例，女性31例，平均年龄(48.25±14.76)岁。每例均经细胞病理学、组织病理学或结合临床资料确诊。所有胸水标本离体后，立即4℃4 000 r/min，离心10 min；取上清，分装后–20 ℃冻存。

　　1.2　　SDSPAGE凝胶电泳
　　
　　制备6%、8%、10%、12%及15%的分离胶和5%浓缩胶。取3 μL胸水与3 μL 2×SDS上样缓冲液混匀，煮沸3 min，离心后上样电泳。设置电压分离胶90 V 30 min，浓缩胶120 V 3 h至溴酚蓝指示剂达凝胶底部时终止电泳，参照文献 ［7-9］行凝胶染色与脱色。
　　 　　
　　染色后的凝胶经凝胶成像系统CCD摄相取图， 用AlphaEaseFC Stand Alone软件行凝胶图像分析，并参照文献［10-11］用图像分析方法定量分析蛋白质含量。

　　1.3　　统计学处理
　　
　　用SPSS13.0统计软件进行数据分析与处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，蛋白条带的分子量选用两样本t检验，蛋白条带的百分含量选用非参数秩和检验，以P＜0.05为差异有显著性。

　　2　　结果

　　2.1　　不同浓度分离胶之凝胶图像
　　 　　
　　图1A～E为不同浓度（6%、8%、10%、12%、15%）的分离胶对胸水中不同分子量的蛋白分离结果，可见在6%和8%分离胶中，只能得到小于10条的大分子蛋白条带，白蛋白及其以下小分子量的蛋白在电场作用下迁移出凝胶。在10%分离胶中，可得到包含白蛋白在内的10～13条蛋白条带。在12%和15%分离胶中，白蛋白（分子量66 kD， 图中深染粗大的条带）及其以下分子量的蛋白得到分离。
　　
　　图1　　胸水蛋白不同浓度分离胶的SDSPAGE凝胶图像（略）

　　Figure 1　　The SDSPAGE image of pleural fluid proteins separated by separation gel of different concentration
　　
　　通过比较不同浓度（6%、8%、10%、12%、15%）的分离胶的凝胶图像，发现10%及12%的分离胶能使40～200 kD范围内的蛋白质得到较好的分离，而胸水中的大部分蛋白质都分布在这一区间。28例肺结核性胸水中有26例、36例肺腺癌性胸水中有32例都稳定检出10条蛋白条带，此外2例肺结核性胸水和4例肺腺癌性胸水可检出13条蛋白条带。对上述稳定检出10条蛋白条带的26例肺结核性胸水和32例肺结核性胸水采用10%分离胶的凝胶图像进行分析。

　　2.2　　肺结核性胸水与肺腺癌性胸水10%SDSPAGE凝胶的蛋白条带及分子量分析
　　
　　肺结核性胸水与肺腺癌性胸水经10%分离胶的SDSPAGE凝胶电泳分离，可稳定检出10条蛋白条带（图2），两组各蛋白条带的分子量见表2。经两样本t检验，两组间各蛋白条带的分子量差异均无显著性（P＞0.05）。这些稳定检出的10条蛋白条带分子量分别为200 kD、152 kD、134 kD、118 kD、103 kD、98 kD、84 kD、62 kD、54 kD、43 kD。

　　2.3　　肺结核性胸水与肺腺癌性胸水各分子量条带的蛋白含量比较
　　 　　
　　表2为肺结核性及腺癌性胸水中稳定检出的10条蛋白条带的蛋白含量分析结果。经非参数秩和检验，200 kD、152 kD、134 kD、118 kD、103 kD、98 kD、84 kD、43 kD这些分子量条带的蛋白含量在肺结核性胸水与肺腺癌性胸水间差异均无显著性（P＞0.05）。肺结核性胸水分子量62 kD和54 kD条带的蛋白含量均高于肺腺癌性胸水，差异具有显著性（P＜0.05）。

　　泳带1、2、3为肺结核性胸水； 4为蛋白分子量Marker，分子量从上至下依次为：95 kD，72 kD，55 kD，43 kD；5、6、7为肺腺癌性胸水

　　图2　　肺结核性及腺癌性胸水10%SDSPAGE凝胶图像（略）

　　Figure 2　　The 10%SDSPAGE image of pleural fluid of lung adenocarcinoma pleural fluid and lung tuberculosis

　　表1　　10%SDSPAGE肺结核性胸水与肺腺癌性胸水各蛋白条带的分子量（略）

　　Table 1　　The molecular wieght of every strap in pleural fluid of lung adenocarcinoma and lung tuberculosis seperateded by 10%SDSPAGE

　　2.4　　蛋白条带波形图分析
　　 　　
　　图3为肺结核性胸水和肺腺癌性胸水两类混合胸水的蛋白条带波形图，可见肺结核性胸水和肺腺癌性胸水的蛋白条带波形基本相似，在分子量50～60 kD区间，肺结核性胸水的蛋白含量高于肺腺癌性胸水。

　　图3　　10%SDSPAGE肺结核性胸水及肺腺癌性胸水凝胶蛋白条带波形图

　　Figure 3　　The oscillogram of protein straps in pleural fluid of lung adenocarcinoma and lung tuberculosis seperateded by 10%SDSPAGE

　　表2　　10%SDSPAGE肺结核性胸水与肺腺癌性胸水各蛋白条带的蛋白百分含量（略）

　　Table 2　　The content in percent of every strap in pleural fluid of lung adenocarcinoma and lung tuberculosis seperateded by 10%SDSPAGE

　　3　　讨论
　　 　　
　　肺结核和肺腺癌是引起胸水的两大病因， 临床上如何早期确诊和及时治疗是常常遇到的难题。本文从胸水蛋白质方面寻找两者间的差异，为其鉴别诊断提供依据。
　　 　　
　　汪得喜等［12］研究应用SELDITOFMS检测了27 例渗出性胸液标本， 对获得的蛋白信号进行分析发现良恶性胸腔积液标本有6个蛋白信号呈现差异，但研究未涉及肺结核和腺癌性胸水的鉴别。
　　 　　
　　区带电泳是临床检验领域中应用最广泛的技术。Chen 等［13］电泳技术应用于胸腔积液渗出液与漏出液的鉴别诊断。秦慧等［14］将琼脂糖凝胶蛋白电泳技术应用于良、恶性胸腔积液的鉴别，结果表明:结核性胸腔积液组的胸液α1 球蛋白、α2 球蛋白及α2 球蛋白/白蛋白的比值均高于肿瘤组， 差异具有显著性。上述研究均采用琼脂糖凝胶电泳方法，均未涉及肺结核和腺癌性胸水的鉴别。由于琼脂糖是大分子筛系统，仅能使大分子量的蛋白质得以分离。SDSPAGE形成的分子筛孔远小于琼脂糖，能使相应蛋白质得到较全面的分离，且分辨率高于琼脂糖电泳［15］。本文将SDSPAGE应用于肺结核性及腺癌性胸水的鉴别诊断，发现与琼脂糖电泳分离相比，能得到更多的蛋白条带，两者胸水蛋白含量在50kD60kD区间有明显差异。
　　
　　SDSPAGE凝胶电泳即SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，是根据电场作用下不同分子量蛋白质在凝胶中的迁移率不同，将蛋白质按分子量大小不同加以分离。不同浓度的分离胶形成的分子筛大小不同，因而分离的蛋白分子量范围也不同。本实验用6%、8%、10%、12%、15%不同浓度的分离胶与5%的浓缩胶分离肺结核性与腺癌性胸水，得到不同分离胶浓度下的蛋白分离图谱。6%或8%的分离胶，由于形成的分子筛筛孔较大，只能使分子量在66 kD(白蛋白)以上的蛋白质得到较好分离；15%的分离胶，由于形成的分子筛筛孔较小，可使分子量在66 kD(白蛋白)以下的蛋白质得到较好分离；10%及12%的分离胶能使40～200 kD范围内的蛋白质得到很好的分离。胸水中的大部分蛋白质都分布在40～200 kD区间，因此，我们进一步用10%分离胶对肺结核性及腺癌性胸水进行了分离，并比较两者间的差异。
　　
　　肺结核性及腺癌性胸水经10%分离胶的SDSPAGE分离，在分子量40～200 kD范围内均可稳定得到10条蛋白条带。这些条带的蛋白分子量分别为200 kD、152 kD、134 kD、118 kD、103 kD、98 kD、84 kD、62 kD、54 kD、43 kD。分子量在54 kD到98 kD之间的蛋白含量占总蛋白含量的60%以上，这部分蛋白为胸水中的高丰度蛋白，其中包含分子量为66 kD的来自血浆的白蛋白［16 ］。
　　 　　
　　凝胶图像分析表明，肺结核性胸水与肺腺癌性胸水均含来自血浆的高丰度的白蛋白（分子量66 kD）。这些高丰度白蛋白的存在，掩盖了低丰度蛋白的显现，使小分子蛋白不能很好分离。因此，为进一步分离，去除胸水中的高丰度白蛋白，将有利于低丰度的小分子蛋白的显现和差异蛋白的检出。此外，28例结核性胸水中有2例，36例肺腺癌性胸水中有4例可检出分子量为166 kD、147 kD和93 kD的3个蛋白条带，这些蛋白是否为肺结核性胸水与肺腺癌性胸水的特异性差异蛋白，有待进一步研究。
　　 　　
　　蛋白含量分析表明，肺结核性胸水分子量62 kD和54 kD蛋白条带的蛋白含量要高于肺腺癌性胸水，且两者间的差异具有显著性（P＜0.05）。混合样本蛋白条带蛋白含量波形分析表明：在分子量50～60 kD区间，肺结核性胸水的蛋白含量要高于肺腺癌性胸水，具有鉴别诊断研究价值。至于这些含量差异的蛋白是何种蛋白，有待进一步研究。

参考文献

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