【摘要】 目的 建立帕米膦酸二钠中β丙氨酸的检测方法。 方法 采用高效液相色谱法，以Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以甲醇0.01 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用氢氧化钠调节pH值至7.0)(体积比30∶70)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm。结果 β丙氨酸的质量浓度在3～18 μg/mL范围内与峰面积呈较好的线性关系，回归方程为y=0.0445x+0.2010，r=0.998 6；平均回收率为99.1%，RSD=1.9%。结论 该法简便、灵敏度高，可用于帕米膦酸二钠中β丙氨酸的质量控制。
【关键词】 帕米膦酸二钠 β丙氨酸 高效液相色谱法
帕米膦酸二钠是一种双膦酸类骨吸收抑制剂，临床上广泛应用于治疗骨质疏松症、肿瘤并发的高钙血症和变形性骨炎［1-3］。帕米膦酸二钠的合成主要以β丙氨酸为原料，同时也是降解的主要产物，因此需要控制帕米膦酸二钠中β丙氨酸的量(拟定为不得超过0.3％)。第30版美国药典、2007年版英国药典和国家食品药品监督管理局国家药品标准WS1—(X—294)—2004Z中，帕米膦酸二钠中β丙氨酸的限度检查均采用薄层色谱法。由于薄层色谱法专属性和灵敏度均不如高效液相色谱法，故本文利用2，4二硝基氟苯与β丙氨酸的胺基进行耦合反应(见图1)，结果衍生物具有紫外吸收，采用紫外检测高效液相色谱法对帕米膦酸二钠中β丙氨酸的限度进行检查。帕米膦酸二钠已被列为中国药典2010年版二部拟新增品种，作为承担单位，本实验方法拟收载在中国药典2010年版二部。
图1 2，4二硝基氟苯与β丙氨酸的反应（略）
Figure 1 Reaction of 2，4dinitrofluorobenzene and βalanine
1 仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪，VWD检测器及其配套色谱工作站；2，4二硝基氟苯(International Laboratory USA，批号：194632，质量分数：99.9％)；β丙氨酸对照品(广东信立泰药业有限公司提供，批号：20061120，质量分数：99.4%)；帕米膦酸二钠(深圳信立泰药业有限公司，批号：20080201；宁波人健药业有限公司，批号：070107、070104、070110；浙江迪耳药业有限公司，批号：060403)；水为超纯水；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇0.01 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用氢氧化钠调节pH值至7.0)(体积比30∶70)；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：360 nm。
2.2 溶液的制备
供试品溶液：精密称取本品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL含帕米膦酸二钠3 mg的溶液，作为供试品溶液。
对照品溶液：精密称取β丙氨酸0.045 25 g置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取2 mL置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
空白溶液：水。
精密量取供试品溶液、对照品溶液和空白溶液各2 mL，分别置10 mL量瓶中，加水3 mL、质量分数5%的碳酸钠水溶液1.0 mL和质量分数4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，摇匀后立刻在40 ℃下反应2 h，取出，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，作为反应后的供试品溶液、对照品溶液和空白溶液。
2.3 专属性试验
精密量取反应后的对照品溶液、供试品溶液(浙江迪耳药业有限公司，批号：060403)和空白溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图(见图2)。由图可知，空白辅料无干扰，反应后的衍生物主峰与相邻峰的分离度符合要求。
1.β丙氨酸
图2 β丙氨酸对照品溶液(A)、供试品溶液(B)和空白溶液(C)的色谱图（略）
Figure 2 Chromatograms of the reference solution (A)，the test solution (B) and the blank solution (C)
2.4 回收率试验
取同一批未检出β丙氨酸的帕米膦酸二钠（深圳信立泰药业有限公司）适量，加水制成每1 mL含6.0 mg的溶液，作为供试品溶液；另根据拟控制的β丙氨酸限度（0.3%），取β丙氨酸适量逐步稀释为每1 mL含18 μg的溶液，作为对照溶液。将供试品溶液与杂质对照溶液按比例混匀配制为含β丙氨酸为限度80%、100％、120％的溶液，测得回收率分别为96.9%、98.8%、97.5%、99.5%、99.2%、101.1%、100.8％、101.7％、96.2％，平均回收率为99.1%，RSD为1.9%。
2.5 线性方程
取对照溶液适量，按比例稀释为含β丙氨酸3、6、9、12、15、18 μg/mL的溶液，分别相当于“2.2”项下供试品溶液的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0. 5%、0.6%的限度对照溶液，依法测定，以峰面积为横坐标，以质量浓度为纵坐标，得线性回归方程为y=0.0445x+0.2010，r=0.998 6，表明β丙氨酸质量浓度在3～18 μg/mL范围内与峰面积呈较好的线性关系，符合限度实验的要求。
2.6 稳定性试验
取一份供试品溶液(浙江迪耳药业有限公司，批号：060403)于配制后0、1、3、5、7、8 h进样，其峰面积的RSD为1.2％，表明溶液在8 h内稳定。
2.7 检测限
取对照品溶液逐级稀释各2 mL，分别置10 mL量瓶中，加水3 mL、质量分数5%的碳酸钠水溶液1.0 mL和质量分数4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，摇匀后立刻在40 ℃下反应2 h，取出，放冷，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取反应后的溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。当β丙氨酸对照品溶液质量浓度为0.1 μg/mL时，信噪比约为3，因此检测限为0.1 μg/mL(以反应前溶液的浓度计)。
2.8 样品测定
分别按“2.2”项下方法配制供试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件进行测定，结果深圳信立泰药业有限公司和宁波人健药业有限公司的帕米膦酸二钠均未检出β丙氨酸，浙江迪耳药业有限公司的帕米膦酸二钠含β丙氨酸为0.1％。
3 讨论
3.1 2，4二硝基氟苯乙腈溶液浓度的影响
取对照品溶液2 mL 5份，分别置10 mL量瓶中，加水3 mL、质量分数5%的碳酸钠水溶液1.0 mL，再向上述5个量瓶分别加3％、4％、5％、7.5％、15％的 2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，摇匀后立刻在40 ℃下反应120 min，取出，放冷，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取反应后的上述溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：当2，4二硝基氟苯乙腈溶液质量浓度为15%时，β丙氨酸主峰附近的干扰峰影响严重；质量浓度为4%～5%时，β丙氨酸主峰面积基本一致，β丙氨酸主峰与其他峰的分离度良好。所以选用质量浓度为4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液。
3.2 反应时间的影响
取对照品溶液2 mL 8份，分别置10 mL量瓶中，加水3 mL、质量分数5%的碳酸钠水溶液1.0 mL和质量分数4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，摇匀后立刻在40 ℃下分别反应20、35、45、60、90、120、150、180 min，取出，放冷，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取反应后的上述溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：反应时间小于60 min时，反应后杂质比较多；反应时间在120～180 min时，β丙氨酸主峰面积基本相同。考虑到反应的完全性、简便性和杂质的干扰性，选择120 min作为反应时间。
3.3 色谱柱的影响
将色谱柱更换为迪马C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），结果表明空白辅料无干扰，同样满足系统适用性要求。
参考文献
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［2］ 蔡玫，许晋星.HPLC法测定帕米膦酸二钠注射液的含量［J］.中国热带医学，2008，8(9):1636-1637.
［3］ 潘义勤，潘秀萍，潘继刚.反相高效液相色谱-荧光检测法测定粉针剂中帕米膦酸二钠含量及有关物质［J］.中国药物应用与监测，2008，5(1):29-31.