作者：王少妹 罗杰 利幼 梁敬仪 贝伟剑
【摘要】 目的 建立脑心清片浸膏中原儿茶酸含量的测定方法。方法 采用HPLC方法，色谱柱为依力特 C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，以乙腈甲醇0.3%H3PO4为流动相进行梯度洗脱，检测波长：260 nm，流速：1 mL/min，柱温：30 ℃。结果 回归方程为A=2508.6 m+63.241，r=0.999 1，线性范围为0.1548～2. 4768 μg；平均回收率为97.36%，RSD为1.21％。结论 该法可用于脑心清片浸膏的半成品质量控制。
【关键词】 脑心清片 原儿茶酸 高效液相色谱法
脑心清片是由单味柿叶提取物(以下简称脑心清片浸膏)制成的中成药，经临床验证，对冠心病心绞痛、脑动脉硬化疗效显著，对短暂脑缺血发作、脑栓塞、脑血栓形成、脑血栓形成后遗症、心肌梗死后遗症等伴有或不伴有高血压、高血压等多种心脑血管疾病有良好的治疗效果，并具有一定的降血压、降血脂作用，长期服用未发现有明显毒副作用［1， 2］。脑心清片浸膏中的黄酮类活性成分的含量控制已有文献报道［3］。脑心清片浸膏中的另一个重要活性成分原儿茶酸［4］，具有抗氧化、清除自由基和神经元保护等功能［1，5］，其质量控制是确保脑心清片高效安全的重要指标之一。本文以HPLC法测定脑心清片浸膏中主要活性成分原儿茶酸的含量，为脑心清片浸膏提供更全面的质量控制方法。
1 实验材料
脑心清片浸膏（柿叶提取物，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供)；甲醇（色谱纯）；原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检验所，批号：110809200503)。
Agilent1100高效液相色谱仪，DADG1315B可见紫外检测器。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性
色谱柱：依力特 C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相:乙腈甲醇0.3%H3PO4，按表1进行梯度洗脱；检测波长：260 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论板数按原儿茶酸计算不低于2 500，拖尾因子1.03；对照品溶液主峰与供试品溶液中原儿茶酸峰保留时间的比值均应在0. 990；原儿茶酸与其他成分有效分离，分离度大于1. 97，见图1。
2.2 对照品溶液制备与线性关系考察
精密称取原儿茶酸对照品适量，加甲醇溶解并定容，分别配制各含原儿茶酸247.68、123.84、61. 92、30. 96、15.48 μg/mL的溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样10 μL各2次，测定峰面积，以峰面积（A）为纵坐标，对照品进样量(m)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为
A=2508.6m+63.241，r=0.999 1
结果表明原儿茶酸进样量在0.154 8～2. 476 8 μg的范围内线性关系良好。
表1 梯度洗脱溶剂系统（略）
Table 1 Slovent system
A.原儿茶酸对照品;B.脑心清片浸膏
图1 脑心清片浸膏中原儿茶酸HPLC图谱（略）
Figure 1 The HPLC graph of protocatechuic acid in Naoxinqing
2．3 供试品溶液制备
精密称取脑心清片浸膏约20 mg，加甲醇20 mL使其完全溶解后，转入50 mL容量瓶，用甲醇定容，制成质量浓度约0.4 mg/mL 的溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2．4 稳定性试验
取原儿茶酸对照品(质量浓度为61.92 μg/mL)甲醇溶液，分别在0、1、2、4、6、8、12、24 h进样10 μL，测定其峰面积。结果原儿茶酸的平均峰面积为2 021.5，RSD值为1.36%。
2．5 精密度试验
取原儿茶酸对照品溶液(质量浓度为61.92 μg/mL)，重复进样6次， 测定原儿茶酸的峰面积，得平均峰面积为2 038.6，RSD值为0.98%。
2.6 重复性试验
取脑心清片浸膏样品（批号C6A002），按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别测定原儿茶酸含量，结果原儿茶酸含量的RSD值为2.16%。
2.7 回收率试验
取同一批已测定含量的脑心清片浸膏的供试品6份，每份约20 mg，分别精密加入200.82 μg/mL原儿茶酸对照品甲醇溶液4.5 mL（相当于20 mg浸膏所含原儿茶酸的量），按“2.3”项下方法制备，测定峰面积，计算原儿茶酸含量和回收率，结果平均回收率为97.36%，RSD为1.21%，见表2。
表2 原儿茶酸的回收率试验结果（略）
Table 2 The Recoveries of protocatechuic acid in HPLC assay
2.8 样品测定
分别按“2.3”项方法制备3批脑心清片浸膏的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果批号C6A001、C6A002、C7A001的样品中原儿茶酸的含量分别为44.5、45.9、44.7 μg/mg。
3 讨论
目前已报道的柿叶有机酸化合物有原儿茶酸、琥珀酸和糠酸等多种有机酸成分［1， 4］。原儿茶酸具有抗氧化、清除自由基和神经元保护等功能［1， 5］，是脑心清片浸膏中的一个重要活性成分。
本文将HPLC法运用于脑心清片浸膏的原儿茶酸含量测定，结果表明方法可靠、可行，为脑心清片的半成品质量控制提供了一个新途径。
参考文献
［1］ BEI Weijian，PENG W L， XU A L，et al. Neuroprotective effects of a standardized extract of diospyros kaki leaves on MCAO transient focal cerebral ischemic rats and cultured neurons injured by glutamate or hypoxia［J］. Planta Medica， 2007，73:636-643.
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［4］ 周法兴，梁培瑜，文洁，等.柿叶化学成分研究［J］.中药通报，1987，12(10):38.
［5］ 姚江雄，贝伟剑.脑心清片防治脑动脉硬化研究进展［J］.广东药学，2004，22：47-51