T细胞受体基因转导及应用的研究进展

　　　　 作者：牟艳芳 张文峰 邵红伟 黄树林

【关键词】 T细胞受体 免疫治疗 基因转导

近年来研究发现，针对特异性抗原的过继性免疫治疗对于包括肿瘤在内的很多疾病是一种很有潜力的治疗方法。T细胞识别抗原的特异性主要由T细胞受体（TCR）决定的，TCR基因转导为肿瘤的过继免疫治疗提供了新途径。通过转导某些疾病相关抗原反应性T细胞克隆的TCR基因，使人外周血淋巴细胞具有针对其相关抗原的靶向性，在疾病治疗方面取得了一定的成效。
　　 　　
　　T细胞受体（TCR）是T细胞表面能够识别和结合蛋白质抗原的特异性受体。当机体受到肿瘤抗原刺激时，由TCR对APC呈递的靶细胞表面抗原肽MHC复合物进行认知来识别抗原。由抗原识别所引发的细胞毒作用或对细胞杀伤效应主要是由CD8+T细胞和NK细胞实现的，而T细胞表面的TCR和CD3分子组成的TCR复合物与肿瘤细胞的MHC抗原肽结合，为T细胞活化提供了第一信号。
　　 　　
　　传统用于过继性免疫治疗的肿瘤抗原特异性的T细胞主要来自于TIL或病人PBMC中分离的CTL单克隆，但是在体外培养T细胞单克隆是非常费力的工作，而且常不能达到所需要的治疗量［1］。近年来，由于相继分离出肿瘤相关抗原和肿瘤抗原特异性TCR基因［2］，这使通过转导TCR基因产生抗原特异性T细胞成为可能，也为得到有治疗价值的T细胞提供了有利的手段。

　　1　　TCR基因的转导技术

　　1．1　　病毒载体系统
　　 　　
　　利用病毒载体将TCR基因转导至T淋巴细胞，可以得到较高的转导效率，目前主要采用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体等。目前在TCR基因转导过程中最常用的是以逆转录病毒作为载体。
　　 　　
　　逆转录病毒载体是第一个被允许用于临床的载体［3］，也是广泛用于实验室研究和临床试验的载体。目前较常用的逆转录病毒载体为 Moloney小鼠白血病病毒改建的各类逆转录病毒载体。这种基因载体宿主细胞广泛，能高效地感染分裂期细胞且能整合到基因组中获得稳定而长期的表达。理论上它能转染几乎100%的靶细胞，但实际的转染效率远低于此［4］。
　　 　　
　　近年来很多研究人员通过改良已经提高了其转染效率。如Scholten［5］等密码修饰通过改变人TCR的α，β链恒定区基因，然后通过逆转录病毒载体LZRS转进CD8+T细胞。通过基因修饰的TCR的α，β基因与野生型的TCR的α，β基因在CD8+ T细胞中的表达比较，发现前者比后者的膜表达水平显著提高。此外在4个月内转染的TCR基因可稳定的表达且保持较高的活性。Engels 等［6］利用逆转录病毒载体将TCRαβ基因转导人初始T细胞，发现在相同的病毒滴度下，以MPSV为基础载体比以MLV为基础的载体有高转染效率和高TCR表达。此外一些构建的其他载体例如pCMMPIRESGFP，当TCR基因嵌合体插入载体中，与传统的载体相比，病毒滴度由6.43×109 VP/L 上升到2.15×1011 VP/L， 转染效率由5%～10%上升到50%～60% ［7］。但逆转录病毒只能感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA 片段长度不超过8 kb，病毒滴度低，不能纯化，而且整合过程中可能引起插入突变，从而引起癌变。
　　 　　
　　腺病毒载体是一种线性双链DNA无包膜病毒。其有广宿主性，可感染分裂和非分裂终末细胞。与逆转录病毒载体相比，外源基因的容纳量大，最高可达36 kb，纯化和浓缩，滴度高，其DNA不能整合于靶细胞DNA中，潜在的致癌危险小。
　　 　　
　　Braciak 和 Pedersen等通过重组腺病毒载体短暂表达TCRVβ8.2基因用于治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎［8］。腺病毒基因组不能整合到宿主细胞基因组上，不能持续表达，外源基因易随着细胞分裂或死亡而消失，表达时间短暂，治疗中需反复转导。除此以外， 容易引起机体的毒性反应和致死性的免疫反应，导致细胞溶解。
　　 　　
　　慢病毒载体克服了逆转录病毒载体的一些缺陷，近年来成为新的研究热点。慢病毒属逆转录病毒之一，包括人艾滋病毒、猴艾滋病毒、羊 Visna /Maedi病毒等 7个亚属。其中最令人关注的是以HIVⅠ为基础构建的。慢病毒载体既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发免疫反应等优点。
　　 　　
　　Joseph［9］等利用慢病毒载体转导TCRαβ基因至JurKat/MA细胞系，通过用启动子hPGK或SFFV调节，转导效率高达85%。Tsuji等通过慢病毒载体将识别 WT1多肽的HLAA24限制性TCRαβ基因转导进PBMCs，转导后CD4+ 和CD8+T细胞中β基因表达明显增加，转导效率明显较高［10］。但慢病毒用作基因治疗载体仍有一定的缺陷，如毒力恢复、垂直感染等安全问题。

　　1．2　　理化转染技术
　　 　　
　　基于对应用病毒载体的生物安全性考虑，目前正试图找到某些基因治疗的替代途径，如通过理化转染技术，其对目的基因的大小无限制，操作简单，较为安全，免疫源性问题少。常用的理化转染技术有电穿孔技术、磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法等，但在TCR基因转导技术中应用较少，原因是应用这些技术很难将基因转导至成熟的T细胞中， 其基因转染的效率还难以和病毒载体相媲美。最近一种新RNA电穿孔技术在TCR基因转导上取得了很好的成果。Zhao［11］等用RNA电穿孔技术来提高转导效率，同时减低或消除毒性。在人PBLs中，转导效率可高达90%，转导效率随时间影响较少。在最佳电转条件下，没有改变T细胞的活性及增殖，也没有引起凋亡。Cohen等通过RNA电穿孔技术将针对p53特异性的TCR的αβ基因转进PBL，效率可高达95%［12］。

　　2　　TCR的应用进展

　　2.1　　肿瘤治疗方面
　　 　　
　　通过 TCR基因修饰 T细胞发挥相应特异性免疫调节或细胞毒活性，在治疗恶性肿瘤等疾病方面具有巨大的发展潜能。
　　 　　
　　肿瘤相关抗原特异 TCR基因转导至T淋巴细胞用于肿瘤的治疗开始于黑色素瘤。由于黑色素瘤细胞与其他肿瘤细胞相比，是很好的抗原提呈细胞，黑色素瘤相关抗原，例如酪氨酸酶，gp100比其他肿瘤相关抗原有高的免疫活性。Clay［13］等将表达于大多数黑色素瘤的肿瘤相关抗原 MART1 特异的HLAI限制性 T细胞克隆的 TCRαβ基因经逆转录病毒转染至人外周血淋巴细胞。结果表明这些细胞能够对MART1肽反应并识别HLAA2+ 黑色素瘤细胞系，而且能够分泌对HLAA2+ 黑色素瘤细胞系反应性的IFNγ。此外一些细胞克隆能够裂解HLAA2+ 黑色素瘤细胞。该研究证明TCR基因转导病人PBL能够在体外产生肿瘤反应性CTL，并能够对转移性黑色素瘤患者产生潜在的治疗作用。
　　 　　
　　2006年，针对黑色素瘤患者的TCR基因治疗的临床试验已经完成。此试验包括17名转移性黑色素瘤患者，利用逆转录病毒载体将黑色素瘤相关抗原MART1特异性的TCR基因转导进自体T细胞来进行治疗。其中15名患者在治疗2个月后，循环T细胞数量上至少增加了10% 。而且其中2名患者完全康控制了病情，并在18月内没有复发。尽管这些数据有限，但对通过TCR基因治疗黑色素瘤产生了深远的影响［14］。
　　 　　
　　TCR基因转导不仅在黑色素瘤治疗上取得了突破性进展，而且也在肝癌、乳腺癌、卵巢癌等的治疗上也取得了一定的成效。

　　 　　
　　p53在肿瘤发生、发展、浸润、转移及诊断治疗方面的作用已成为研究的热点。p53蛋白在多种恶性肿瘤中表达上调，Cohen［12］等从识别人p53 (264-272)多肽表位的小鼠高亲合力 CTL中克隆出TCRαβ基因，通过逆转录病毒载体转导人原代T细胞。转导后 T细胞可识别转染野生型和突变型 p53 蛋白的 HLAA2.1+细胞。p53TCR转导细胞后可识别和杀伤大量肿瘤细胞。他们通过筛选HLAA2和p53都表达的肿瘤细胞，HLAA2+/p53+肿瘤细胞如肝癌细胞HepG2，乳腺癌细胞MDAMB231等，HLAA2-/p53+和HLAA2+/p53-肿瘤细胞，将其与p53-TCR转导的PBLs共培养，发现HLAA2+/p53+共培养组明显产生大量TFNγ 和IL2，而其余两个组则没有明显产生，同时其他的细胞因子也在前者中检测出，如IL4，IL10，TNFα等。
　　 　　
　　近年来研究发现高达60%的卵巢癌细胞和25%的乳腺癌细胞都表达cdr2。Santomasso［15］等从cdr2特异性HLAA2.1T细胞中克隆TCRαβ基因，将编码TCR的RNA通过电穿孔进人的CD8+T细胞，可以高效的杀伤cdr2表达的肿瘤细胞，为妇科癌症的治愈提供了新的途径。
　　 　　
　　最近的研究也将 TCR基因转导引进白血病免疫治疗研究中。肿瘤抗原特异性细胞包括 CD4+和CD8+T细胞，尤其是产生IFNγ的Th1和Tc1在治疗肿瘤方面起着关键作用。Tsuji［10］等从WT1特异性Tc克隆中分离出HLA2A24限制性TCRα和β基因，用慢病毒载体转导进Th1和 Tcl细胞。基因修饰的Th1和 Tcl细胞对表达 HLA2A24+/WT1+的原代白血病细胞具有细胞毒活性和产生IFNγ，其中转导后Tcl细胞还产生了大量的IL2。后期动物实验也证明了 WT1TCR修饰 T细胞可以清除小鼠体内的白血病细胞［16］。通过TCR基因修饰病人T细胞，开展白血病特异免疫治疗的研究已在多方面进行中。
　　 　　
　　在肿瘤治疗过程中TCR基因转导常对受者T细胞存在HLA限制性，为了提高转导的肿瘤特异性TCR基因对特异性肿瘤抗原的亲和力，近年来的一些研究采用基因工程手段，构建嵌合TCR基因转染T细胞进行肿瘤免疫治疗［17，18］。用嵌合了抗原肽的TCR基因修饰T细胞，在体内和体外实验中显示出具有靶向性的抗肿瘤作用。Crittenden［18］等用基因工程手段使T细胞表达嵌合了癌胚抗原CEA抗原肽的TCR结果表明，这种细胞可特异性识别表达肿瘤相关癌胚抗原地靶细胞，嵌合TCR基因可以细胞为携带物使载体产物靶向性聚集而达到全身治疗目的。

　　2.2　　TCR DNA 疫苗方面
　　 　　
　　TCR基因除了作为靶向性治疗的向导基因外，还可以作为靶基因用于治疗。近年来用TCR DNA疫苗来治疗某些疾病的研究已经逐渐开展起来。TCR DNA疫苗作为一种基因疫苗，通过在机体内部表达抗原蛋白，诱发机体产生特异性免疫应答，选择性地杀伤致病性 T 细胞或使其失活而发挥治疗作用。目前用于自身免疫病研究较多，并在一些动物模型中进行了尝试， 都取得了不错的效果。
　　 　　
　　Matsumoto［19］ 等通过用实验性自身免疫性心肌炎（EAM）鼠模型进行研究。对其外周血 T细胞进行谱型分析发现TCRVβ8.2， Vβ10和Vβ12T细胞存在寡克隆扩增。进一步研究发现Vβ10的扩增在发病期间始终存在，而Vβ8.2的寡克隆扩增主要存在于发病早期。他们用这2种基因制成 TCRDNA疫苗对EAE鼠进行治疗，结果病鼠的组织损伤程度降低，证明有一定的治疗作用。Wu 等将TCRVβ5，Vβ7和Vβ13构建到重组质粒中，制成疫苗表达 TCR 抗原蛋白，肌肉注射海曼肾炎模型的大鼠，在免疫后的第6、 8、 10、12周分别测定大鼠蛋白尿的情况。与对照组相比，疫苗组的蛋白尿量显著减少，在第 12 周对肾小球的检测也表明CD8+T细胞浸润明显低于其他组，说明该 TCR DNA 疫苗有治疗作用。该疫苗在大鼠体内诱导产生了特异性自身抗体［20］。
　　 　　
　　免疫治疗是目前治疗恶性肿瘤及其他疾病的重要辅助方法，TCR基因转导在肿瘤的免疫治疗以及其他疾病中显示出巨大的潜能，并且随着以后的深入研究，克服现在的一些缺陷，将会在一些疾病的发生、发展机制以及预防治疗中发挥重要的作用。

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